产酶益生芽孢杆菌的筛选

任平等

摘要：从畜禽动物胃肠道分离具有产酶能力及抑菌活性的芽孢杆菌，对其进行耐酸、耐胆盐、产酶能力及抑菌试验，并结合其形态特征进行生理生化试验鉴定。结果表明，J2、J3和J14具有较强的产淀粉酶和蛋白酶的特性，N7和N10产纤维素酶能力较强，5株芽孢杆菌均有较强的抑菌活性并且能抵抗高浓度胃酸、胆盐的不良环境，具有较高的存活数。初步鉴定J3为地衣芽孢杆菌，J14、J2为蜡样芽孢杆菌，N7、N10枯草芽抱杆菌。

关键词：产酶；益生芽孢杆菌；形态特征；抑菌；生理生化；产酶能力；低pH值耐受性；高胆盐耐受性；饲用益生菌

中图分类号： Q93-331文献标志码： A文章编号：1002-1302（2014）10-0362-03

收稿日期：2013-12-27

基金项目：陕西省西安市科技计划（编号：NC10013）。

作者简介：任平（1972—），女，陕西临潼人，副研究员，主要从事微生物资源的应用开发。E-mail：mysrenping@163.com。芽孢杆菌（Bacillus）是一类重要的微生物资源，因其具有强抗逆性、抗胃酸、抗干燥、耐高温高压、易贮存等生物特性而成为近20年发展起来的新型活菌绿色饲料添加剂，在畜牧业和饲料行业中得到了广泛的应用。当微生态制剂所用的芽抱杆菌进入动物消化道后，能分泌活性很强的胞外酶（蛋白酶、纤维素酶、脂肪酶、淀粉酶），仅降解饲料中相应的营养成分，提高消化率，降低料肉比[1]，可刺激机体本身酶的活性，提高动物的生产性能[2]；并且可拮抗病原微生物，维持和调整肠道微生态平衡，减少腹泻，预防疾病。它具有抗生素和酶的双重功效，在替代抗生素、防治畜禽疾病和改善环境等方面的积极作用已经得到了公认，在绿色畜牧业生产中具有广泛的开发前景[3]。

微生态制剂的生命力全赖于其所选菌种及菌种间相互配合是否严格，按微生态学规律精心筛选和制备。由于宿主的正常菌对本宿主（包括人或动物）有其特异性，因此选择微生态制剂的菌种要求利用本动物体内所分离的菌种，因为本动物的菌种对其宿主肠道有较强的黏附性，对其他宿主则表现出低黏附性或不黏附。益生菌菌株定植的宿主特异性直接影响益生菌制剂的应用效果，因而菌种的分离选择必须注意到宿主特异性问题[4]，从动物胃肠道分离的菌株，由于该菌株经过长期的历史进化过程与宿主形成了供体和受体的共生关系，一定程度上保证了菌株对动物的安全性，而且畜禽解剖构造和生理体温与其他动物不同，从其他（包括人、动物、植物、土壤）处分离的菌种，很难在畜禽体内存活，更谈不上较强的黏附力，与致病菌争夺附着点。因此，菌种的选择对畜禽微生态制剂的应用效果至关重要，理想的益生素菌种最好来自同源动物的胃肠道。本研究从牛瘤胃及鸡盲肠中筛选出对低pH值和高胆盐有较好的耐受性、产酶能力及抑菌活性较强的芽孢杆菌菌株，为饲用益生菌产品的开发和应用打下基础。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1样品来源鸡盲肠内容物、牛新鲜的瘤胃内容物。

1.1.2指示菌金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、大肠杆菌（Escherichia coli）、肠炎沙门氏菌（Salmonella typhimurium），从北微生物研究所购买。

1.1.3培养基（1）肉汤培养基：牛肉膏 5.0 g，蛋白胨 3 g，NaCl 5 g，水 1 L，pH值7.2。（2）分离纯化培养基：牛肉膏 50 g，蛋白胨 10 g，NaCl 5 g，琼脂15 g，水 1 L，pH值7.2。（3）CMC-Na（羧甲基纤维素钠）培养基：CMC-Na 1%，大豆蛋白胨0.5%，酵母粉0.05%，K2HPO4 0.15%，MgSO4·7H2O 0.02%，NaCl 05%，琼脂粉0.8%，pH值为7.0。

1.2试验方法

1.2.1芽孢杆菌的预筛选和增殖培养活鸡剖杀，无菌操作刮取盲肠内容物约5 g，置于盛有95 mL无菌生理盐水的带有玻璃珠的三角瓶中，充分振荡摇匀；将三角瓶于80 ℃水浴中处理15 min，挑取水浴后的菌液于菌种纯化培养基平板上划线培养，置于37 ℃下培养48 h，挑取单个菌落革兰氏染色镜检，取G+芽孢杆菌继续纯化培养。取新鲜牛瘤胃内容物5 g于95 mL灭菌生理盐水中，振荡摇匀，置于80 ℃水浴中 15 min；挑取水浴后的菌液于菌种纯化培养基平板上划线培养，置于培养箱中37 ℃培养48 h，挑取单个菌落革兰氏染色镜检，取G+芽孢杆菌继续纯化培养。

1.2.2芽孢杆菌的筛选挑取少量纯培养的单菌落均匀涂于玻片上，进行结晶紫简单染色并镜检，将产生芽孢且形态为杆状的单菌落转入斜面保存。

1.2.3pH值耐受性取1环斜面菌株接种到营养肉汤培养基中，于37 ℃、180 r/min 下培养 36 h；再以5%的接种量接种于pH值为 3.0的肉汤培养液中，于37 ℃、180 r/min 下培养2 h；分别于0、2 h取样，用无菌移液管取出1 mL进行梯度稀释10-1～10-7；取10-4～10-7梯度0.2 mL涂于平板上进行菌落计数，并计算存活率。

1.2.4猪胆盐耐受性以5%的接种量将种子液接入含 3 mg/mL 猪胆盐的营养肉汤培养基中，于37 ℃、180 r/min 下摇瓶培养 2 h；分别于0、2 h取样，用无菌移液管取出1 mL进行梯度稀释10-1～10-7；取10-4～10-7梯度0.2 mL涂于平板上进行菌落计数，并计算存活率。

1.2.5产酶特性

1.2.5.1鸡源微生物产淀粉酶和蛋白酶特性挑选对低pH值和猪胆盐耐受性较好的芽孢杆菌菌株，并用无菌牙签将这些菌株分别点种于淀粉培养基和酪蛋白培养基中（以点种在营养琼脂平板作为生长对照），37 ℃培养 24 h后取出平板观察透明圈大小（淀粉平板放入冰箱 4 ℃冷却 12 h，再取出观察透明圈大小）。

1.2.5.2牛源微生物产纤维素酶特性挑选对低 pH 值和猪胆盐耐受性较好的芽孢杆菌菌株，在CMC-Na平板上以3点种植方法培养48 h，再采用刚果红染色30 min，依次用蒸馏水和1 mol/L NaCl彻底洗去染液，再用5%醋酸固定颜色，在菌落周围形成透明的菌落证明芽抱杆菌能产纤维素酶。分别测量透明圈直径（D）和菌落直径（d），选择两者比值。

1.2.6抑菌试验将3种指示菌分别接种于肉汤液体培养基中，于37 ℃、180 r/min下摇床培养24 h，活菌计数，将菌液浓度调为1亿CFU/mL待用。采用琼脂打孔扩散法测定抑菌效果，过程为：在灭菌平皿中加入100 μL的 1亿CFU/mL指示菌菌液，然后注入温热的肉汤固体培养基，混匀，培养基厚度约为5 mm；待培养基冷却后，用打孔器在培养基上打3～4个直径为5 mm的孔，将待检测的芽孢杆菌接种于普通营养肉汤培养基上，于37 ℃下培养36 h；将菌液加满于打好的孔中，于37 ℃培养24 h，测定抑菌圈直径，重复3次。

1.2.7纤维素酶活性的测定采用DNS法。

2结果与分析

2.1芽孢杆菌的筛选

利用芽孢的耐热特性，对样品进行水浴，达到筛选的目的。通过水浴处理和增殖培养，试验共分离耐热菌株40株，经革兰氏染色镜检，从中筛选出21株芽孢杆菌。

2.2耐受低 pH值芽孢杆菌株的筛选

根据菌体产酶特性和对病原菌的抑菌效果，J2、J3、J14具有较强的产淀粉酶和蛋白酶的特性，N7和N10产纤维素酶能力较强，5株芽孢杆菌均有抑菌作用。经其形态特征、菌落特征、生理生化特征分析，初步鉴定J3为地衣芽孢杆菌，J14、J2为蜡样芽孢杆菌，N7、N10枯草芽抱杆菌。

参考文献：

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高效石油降解菌BS-8产生物表面活性剂的性能常慧萍1， 杨雪1， 王丁1， 邢文会1， 夏铁骑2， 张红1

（1.河南教育学院生命科学系，河南郑州 450046； 2.濮阳职业技术学院，河南濮阳457000）摘要：培养6～30 h，随着菌体数量的迅速增加，菌株BS-8表面张力从63.2 mN/m快速下降为39.4 mN/m，其表面活性剂产生方式为生长相关型；以葡萄糖为碳源，对菌株BS-8的培养液经离心、沉淀、显色，显示其表面活性剂为脂肽类物质，从培养液中分离纯化得到表面活性剂的产量为0.58 g/L，其临界胶束浓度（CMC）为90 mg/L；在pH值 4～9、温度20～70 ℃、NaCl浓度1%～6%的条件下，菌株BS-8产生物表面活性剂的稳定性较强。

关键词：石油；降解菌BS-8；生物表面活性剂；脂肽类物质；稳定性

中图分类号：Q939.9文献标志码： A文章编号：1002-1302（2014）10-0365-03

收稿日期：2014-01-18

基金项目：河南省科技攻关重点项目（编号：142102110123、122102310350）；河南省教育厅自然科学研究计划（编号：12A180008）；河南教育学院青年课题（编号：20090105）。

作者简介：常慧萍（1970—），女，河南新乡人，博士，副教授，主要从事微生物资源开发与应用研究。Tel：（0371）69303781；E-mail： shengwuchp@126.com。

通信作者：张红，博士，教授，硕士生导师，主要从事分子生物学与免疫学研究。Tel：（0371）69303663；E-mail： angela9922@sina.com。生物表面活性剂是利用酶或微生物等，通过生物催化和生物合成等技术，从微生物、植物或动物上得到的具有表面活性的物质，按化学结构不同分为糖脂类、脂肽和脂蛋白类、磷脂和脂肪酸类、聚合表面活性剂类和微粒表面活性剂等五大类[1]，其类型既与菌株有关，也与作为底物的碳源有关。有研究表明，碳源对微生物表面活性剂的产量和结构具有决定性作用，烃类物质的存在尤其是烃链长度对培养液中表面活性剂的浓度也会有显著的影响[2]。不同的生物表面活性剂具有不同的分离、提取和浓缩方法，有的生物表面活性剂用乙酸乙酯提取，有的用二氯甲烷或甲醇与三氯甲烷按1 ∶2的比例提取。生物表面活性剂有较强的理化稳定性，可被应用于极端环境下，如地衣芽孢杆菌（Baclicus licheniform）产生的脂肽可以在75 ℃条件下耐热140 h，铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）产生的类蛋白表面活性剂在pH值为 1.7～11.4范围内均非常稳定[3]。生物修复被烃类和原油污染的土壤是生物表面活性剂的一个重要应用，同时还可用于受铀、铬和铅等毒性重金属污染地区的生物修复[4]。笔者所在课题组从长期受石油污染的土壤中筛选到1组产生物表面活性剂的菌株，对具有较高表面活性剂产量及活性的菌株BS-8（Bacillus sp.）产生物表面活性剂进行提取、纯化，并对影响表面活性剂稳定性的因素进行探讨，为生物表面活性剂及其产生菌在石油污染土壤的生物修复中提供一些理论依据。

1材料与方法

1.1菌株

降解菌BS-8从长期受石油污染的土壤中筛选到[5]。

1.2培养基

LB培养基：胰蛋白胨10 g/L、酵母提取物5 g/L、NaCl 10 g/L、琼脂20 g/L，pH值 7.0；发酵培养基：葡萄糖 20.0 g/L、（NH4）2SO4 2.0 g/L、MgSO4·7H2O 0.5 g/L、KH2PO4 2.0 g/L、Na2HPO4 2.0 g/L、CaCl2·H2O 0.005 g/L，pH值7.0～7.2。

1.3表面张力的测定[6]

采用圆环法测定表面张力。室温下，用JYW-200A自动表面张力测定仪测定上清液的表面张力，3次重复。

1.4菌株BS-8产表面活性剂与菌体生长的动态关系

将菌株BS-8以10%的接种量接种到发酵培养基中，在30 ℃、160 r/min下振荡培养，每隔6 h取样，用紫外分光光度计测定发酵液的D600 nm，并测定离心后发酵上清液的表面张力。

1.5菌株BS-8产生物表面活性剂的性能分析

1.5.1生物表面活性剂的定性分析将菌株BS-8活化后接种到发酵培养基中，于30 ℃、160 r/min 下振荡培养48 h，将培养液于4 ℃、10 000 r/min条件下离心20 min，收集上清液，用6 mol/L HCl将其pH值调至2～3，置于4 ℃冰箱中过夜，观察其是否会产生白色沉淀，若出现白色沉淀，则上清液中含脂肽类或脂蛋白类表面活性剂；若没有白色沉淀，则表明菌株产生了糖脂类表面活性剂[7]。

为进一步确定表面活性剂的性质，通过显色反应分析表面活性剂的类型。通过双缩脲、茚三酮显色反应确定上清液中含肽键的脂肽、脂蛋白类表面活性剂；通过莫氏试验验证上清液中是否含糖或糖的衍生物。用乙酸乙酯萃取上清液中的表面活性剂，萃取液浓缩作硅胶薄层层析，展开剂为三氯甲烷-甲醇（体积比为9 ∶1），显色剂为苯酚-硫酸-无水乙醇（比例为3 g ∶10 mL ∶25 mL），糖脂类表面活性剂显棕色斑点；显色剂为含 0.5%茚三酮的无水丙酮溶液，脂肽、脂蛋白类表面活性剂显红色斑点[8]。

1.5.2生物表面活性剂的提取与纯化菌株BS-8活化后接种到发酵培养基中，30 ℃、160 r/min 振荡培养72 h，发酵液于10 000 r/min、4 ℃下离心 20 min ，以去除菌体；上清液用 6 mol/L HCl调pH值至2.0，4 ℃下静置12 h，再次离心收集沉淀；用少量稀HCl洗涤沉淀，1 mol/L NaOH将沉淀pH值调至 7.0，冷冻干燥得到表面活性剂粗品[9]。

将表面活性剂粗品用CH2Cl2萃取，减压蒸馏后溶于001 mol/L NaOH，滤纸过滤，再次用6 mol/L HCl将滤液pH值调至2.0，出现沉淀时于10 000 r/min下离心20 min，真空干燥得到纯化的生物表面活性剂[10]。

1.5.3表面活性剂的临界胶束浓度（CMC）的测定临界胶束浓度指表面活性剂分子在溶剂中形成胶束时的最低浓度，是表面活性剂性能的一个重要指标。当溶液达到临界胶束浓度时，溶液的表面张力降到了最低，此时表面活性剂浓度再增大，溶液的表面张力也不会再下降，而且形成大量的胶团。CMC对应的溶液表面张力就是表面活性剂能达到的最小表面张力。

用纯化得到的表面活性剂样品制成0、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120 mg/L系列浓度的表面活性剂水溶液，在室温（25±1） ℃下测量各浓度表面活性剂水溶液的表面张力，以表面活性剂浓度为横坐标、溶液表面张力为纵坐标绘制曲线，以确定表面活性剂的临界胶束浓度。

1.6影响生物表面活性剂稳定性的因素

取纯化的表面活性剂样品溶于蒸馏水中，配制成浓度为100 mg/L的溶液，研究pH值、温度、盐浓度等理化因子对其稳定性的影响。

1.6.1温度对生物表面活性剂稳定性的影响分别将 100 mg/L 表面活性剂溶液加热到20、30、40、50、60、70、80、90、100 ℃，保持2 h，冷却至室温后测定溶液的表面张力，观察其热稳定性。

1.6.2 pH值对生物表面活性剂稳定性的影响分别将 100 mg/L 表面活性剂溶液的pH值调至3、4、5、6、7、8、9、10、11，然后测定其表面张力，考察其对酸碱的耐受度。

1.6.3NaCl浓度对生物表面活性剂的影响分别在 100 mg/L 表面活性剂溶液中加入一定量的NaCl，混匀，使NaCl浓度为1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%，静置24 h后测其表面张力，考察其对盐的耐受度。

2结果与分析

2.1表面活性剂的产生与菌体生长的动态关系

菌株BS-8在发酵培养基中振荡培养，定时取样，测定发酵液的D600 nm及离心上清液的表面张力，以培养时间为横坐标、发酵液的表面张力为纵坐标绘制BS-8的菌体生长与产表面活性剂的动态关系（图1）。由图1可知，菌株BS-8在培养6 h后进入对数期，并开始产生表面活性剂，6～30 h间菌体数量迅速增加，发酵液的表面张力随菌体密度的增大而降低，表面张力快速下降（从63.2 mN/m下降为 39.4 mN/m）；30～54 h间细菌密度较高，并维持在一稳定范围内，随着菌体密度缓慢增长，表面张力持续下降但降速减慢。发酵液的表面张力也降至最低（34.1 mN/m）；54～72 h间，菌体数量有所下降，表面张力有所增加。说明生物表面活性剂的产生与菌体生长过程密切相关，菌株BS-8的表面活性剂产生方式为生长相关型。

2.2菌株BS-8产生物表面活性剂的性能分析

以葡萄糖为碳源，将菌株BS-8培养后的离心上清液pH值调至2～3，4 ℃冰箱中过夜，观察到有白色沉淀产生，经硅胶薄层层析后，含0.5%茚三酮的无水丙酮溶液显红色斑点，判断上清液中含脂肽、脂蛋白类表面活性剂。菌株BS-8振荡培养72 h，从发酵离心上清液中提取表面活性剂，测得表面活性剂的含量为0.58 g/L。

将纯化后的表面活性剂配制成不同浓度的水溶液，测定菌株 BS-8 产生的表面活性剂的CMC，结果见图2。郑新伟筛选到的菌株所产表面活性剂的CMC为130 mg/L，菌株 BS-8 的表面活性剂CMC为90 mg/L，两者均比一般的化学表面活性剂的CMC值低1～2个数量级，所以在性能上更具优越性[10]。图2表明，表面活性剂的浓度从0增大到30 mg/L时，表面张力快速下降，从68.7 mN/m降到41.8 mN/m；随着表面活性剂浓度的增大，表面张力下降幅度变小，当表面活性剂浓度增大到90 mg/L时，表面张力降到最低（35.6 mg/L），表面活性剂浓度再升高，溶液的表面张力也不再降低。

2.3影响生物表面活性剂稳定性的因素

2.3.1表面活性剂在不同温度下的稳定性将100 mg/L表面活性剂溶液分别加热到不同温度并保持2 h，室温时各溶液表面张力的测定结果如表1所示。由表1可知，20～70 ℃之间，表面活性剂溶液的表面张力随温度的变化不大，基本保持在36.2～37.2 mN/m之间；当温度超过70 ℃以后，表面张力有较大提高。说明菌株BS-8在20～70 ℃具有良好的热稳定性。

表1不同温度下菌株BS-8产生的表面活性剂的稳定性

温度（℃）表面张力（mN/m）2036.83036.24036.65036.96036.87037.28038.69039.810040.7

2.3.2表面活性剂在不同pH值下的稳定性100 mg/L表面活性剂溶液在不同pH值下保持2 h，各溶液表面张力的测定结果如表2所示。由表2可知，pH值在4～9之间时，菌株产生的表面活性剂表面张力随pH值的变化不太明显，基本稳定在36.5～37.5 mN/m；而当pH值<4或pH值>9时，表面张力增加，强酸强碱影响表面活性剂的活性。但总的来说，菌株BS-8产生的表面活性剂有较宽的酸碱范围。

表2pH值对菌株BS-8产生的表面活性剂的稳定性的影响

pH值表面张力（mN/m）338.3436.9536.6636.8736.9836.8937.21038.31139.8

2.3.3表面活性剂在不同NaCl浓度下的稳定性将NaCl添加到含100 mg/L表面活性剂溶液中，使其成为一系列NaCl浓度梯度的溶液，保持2 h，测定各溶液的表面张力，结果如表3所示。表3表明，表面活性剂溶液的NaCl浓度在1%～6%之间，溶液表面张力的变化随盐度的变化很小，表面张力基本稳定在36.5～37.2 mN/m范围内，说明菌株BS-8产生的生物表面活性剂在NaCl浓度为1%～6%之间有较强的耐盐性；当NaCl浓度>6%时，表面张力增幅较大。

表3 不同盐度下菌株BS-8产生的表面活性剂的稳定性

NaCl浓度（%）表面张力（mN/m）136.6236.8336.7436.9536.8637.2738.2838.8940.2

3结论

菌株BS-8的表面活性剂产生方式为生长相关型，在培养6～30 h时，随菌体数量的迅速增加，表面张力从 63.2 mN/m 快速下降为39.4 mN/m；之后，菌体密度缓慢增长，表面张力持续下降但降速减慢。以葡萄糖为碳源培养菌株BS-8，培养液中含脂肽、脂蛋白类表面活性剂，从培养液中分离、纯化得到表面活性剂的产量为0.58 g/L，表面活性剂的CMC为90 mg/L。表面活性剂在pH值4～9、温度20～70 ℃、NaCl浓度1%～6%的范围内具有较强的稳定性。

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以葡萄糖为碳源，将菌株BS-8培养后的离心上清液pH值调至2～3，4 ℃冰箱中过夜，观察到有白色沉淀产生，经硅胶薄层层析后，含0.5%茚三酮的无水丙酮溶液显红色斑点，判断上清液中含脂肽、脂蛋白类表面活性剂。菌株BS-8振荡培养72 h，从发酵离心上清液中提取表面活性剂，测得表面活性剂的含量为0.58 g/L。

将纯化后的表面活性剂配制成不同浓度的水溶液，测定菌株 BS-8 产生的表面活性剂的CMC，结果见图2。郑新伟筛选到的菌株所产表面活性剂的CMC为130 mg/L，菌株 BS-8 的表面活性剂CMC为90 mg/L，两者均比一般的化学表面活性剂的CMC值低1～2个数量级，所以在性能上更具优越性[10]。图2表明，表面活性剂的浓度从0增大到30 mg/L时，表面张力快速下降，从68.7 mN/m降到41.8 mN/m；随着表面活性剂浓度的增大，表面张力下降幅度变小，当表面活性剂浓度增大到90 mg/L时，表面张力降到最低（35.6 mg/L），表面活性剂浓度再升高，溶液的表面张力也不再降低。

2.3影响生物表面活性剂稳定性的因素

2.3.1表面活性剂在不同温度下的稳定性将100 mg/L表面活性剂溶液分别加热到不同温度并保持2 h，室温时各溶液表面张力的测定结果如表1所示。由表1可知，20～70 ℃之间，表面活性剂溶液的表面张力随温度的变化不大，基本保持在36.2～37.2 mN/m之间；当温度超过70 ℃以后，表面张力有较大提高。说明菌株BS-8在20～70 ℃具有良好的热稳定性。

表1不同温度下菌株BS-8产生的表面活性剂的稳定性

温度（℃）表面张力（mN/m）2036.83036.24036.65036.96036.87037.28038.69039.810040.7

2.3.2表面活性剂在不同pH值下的稳定性100 mg/L表面活性剂溶液在不同pH值下保持2 h，各溶液表面张力的测定结果如表2所示。由表2可知，pH值在4～9之间时，菌株产生的表面活性剂表面张力随pH值的变化不太明显，基本稳定在36.5～37.5 mN/m；而当pH值<4或pH值>9时，表面张力增加，强酸强碱影响表面活性剂的活性。但总的来说，菌株BS-8产生的表面活性剂有较宽的酸碱范围。

表2pH值对菌株BS-8产生的表面活性剂的稳定性的影响

pH值表面张力（mN/m）338.3436.9536.6636.8736.9836.8937.21038.31139.8

2.3.3表面活性剂在不同NaCl浓度下的稳定性将NaCl添加到含100 mg/L表面活性剂溶液中，使其成为一系列NaCl浓度梯度的溶液，保持2 h，测定各溶液的表面张力，结果如表3所示。表3表明，表面活性剂溶液的NaCl浓度在1%～6%之间，溶液表面张力的变化随盐度的变化很小，表面张力基本稳定在36.5～37.2 mN/m范围内，说明菌株BS-8产生的生物表面活性剂在NaCl浓度为1%～6%之间有较强的耐盐性；当NaCl浓度>6%时，表面张力增幅较大。

表3 不同盐度下菌株BS-8产生的表面活性剂的稳定性

NaCl浓度（%）表面张力（mN/m）136.6236.8336.7436.9536.8637.2738.2838.8940.2

3结论

菌株BS-8的表面活性剂产生方式为生长相关型，在培养6～30 h时，随菌体数量的迅速增加，表面张力从 63.2 mN/m 快速下降为39.4 mN/m；之后，菌体密度缓慢增长，表面张力持续下降但降速减慢。以葡萄糖为碳源培养菌株BS-8，培养液中含脂肽、脂蛋白类表面活性剂，从培养液中分离、纯化得到表面活性剂的产量为0.58 g/L，表面活性剂的CMC为90 mg/L。表面活性剂在pH值4～9、温度20～70 ℃、NaCl浓度1%～6%的范围内具有较强的稳定性。

参考文献：

[1]Benincasa M，Contiero J，Manresa M A，et al. Rhamnolipid production by Pseudomonas aeruginosa LBI growing on soapstock as the sole carbon source[J]. Journal of Food Engineering，2002，54（4）： 283-288.

[2]Kim H S，Jeon J W，Kim B H，et al. Extracellular production of a glycolipid biosurfactant，mannosylerythritol lipid，by Candida sp. SY16 using fed-batch fermentation[J]. Applied Microbiology and Biotechnology，2006，70（4）：391-396.

[3]Lu J R，Zhao X B，Yaseen M. Biomimetic amphiphiles： biosurfactants[J]. Current Opinion in Colloid and Interface Seienee，2007，12：60-67.

[4]Meagher R B. Phytoremediation of toxic elemental and organic pollutants[J]. Current Opinion in Plant Biology，2000，3（2）： 153-162.

[5]夏铁骑，常慧萍，张建清.产生物表面活性剂石油降解菌的筛选及高效降解菌群的构建[J]. 农业灾害研究，2013，3（6）：49-51.

[6]曹娟，徐志辉，李凌之，等. 产生物表面活性剂的石油降解菌Acinetobacter BHSN 的研究[J]. 生态与农村环境学报，2009，25（1）：73-78.

[7]冷凯良，楚晓珉，张辉珍，等. 微生物对石油烃降解代谢产物的分析方法研究[J]. 海洋水产研究，2001，22（2）：57-61.

[8]董晓燕.生物化学实验[M]. 北京：化学工业出版社，2003：46-47.

[9]Bordoloi N K，Konwar B K. Microbial surfactant-enhanced mineral oil recovery under laboratory conditions[J]. Colloids and Surfaces B-Biointerfaces，2008，63（1）： 73-82.

[10]郑新伟.一株生物表面活性剂产生菌的分离及其产物性质的研究[D]. 西安：西北大学，2011：31.

以葡萄糖为碳源，将菌株BS-8培养后的离心上清液pH值调至2～3，4 ℃冰箱中过夜，观察到有白色沉淀产生，经硅胶薄层层析后，含0.5%茚三酮的无水丙酮溶液显红色斑点，判断上清液中含脂肽、脂蛋白类表面活性剂。菌株BS-8振荡培养72 h，从发酵离心上清液中提取表面活性剂，测得表面活性剂的含量为0.58 g/L。

将纯化后的表面活性剂配制成不同浓度的水溶液，测定菌株 BS-8 产生的表面活性剂的CMC，结果见图2。郑新伟筛选到的菌株所产表面活性剂的CMC为130 mg/L，菌株 BS-8 的表面活性剂CMC为90 mg/L，两者均比一般的化学表面活性剂的CMC值低1～2个数量级，所以在性能上更具优越性[10]。图2表明，表面活性剂的浓度从0增大到30 mg/L时，表面张力快速下降，从68.7 mN/m降到41.8 mN/m；随着表面活性剂浓度的增大，表面张力下降幅度变小，当表面活性剂浓度增大到90 mg/L时，表面张力降到最低（35.6 mg/L），表面活性剂浓度再升高，溶液的表面张力也不再降低。

2.3影响生物表面活性剂稳定性的因素

2.3.1表面活性剂在不同温度下的稳定性将100 mg/L表面活性剂溶液分别加热到不同温度并保持2 h，室温时各溶液表面张力的测定结果如表1所示。由表1可知，20～70 ℃之间，表面活性剂溶液的表面张力随温度的变化不大，基本保持在36.2～37.2 mN/m之间；当温度超过70 ℃以后，表面张力有较大提高。说明菌株BS-8在20～70 ℃具有良好的热稳定性。

表1不同温度下菌株BS-8产生的表面活性剂的稳定性

温度（℃）表面张力（mN/m）2036.83036.24036.65036.96036.87037.28038.69039.810040.7

2.3.2表面活性剂在不同pH值下的稳定性100 mg/L表面活性剂溶液在不同pH值下保持2 h，各溶液表面张力的测定结果如表2所示。由表2可知，pH值在4～9之间时，菌株产生的表面活性剂表面张力随pH值的变化不太明显，基本稳定在36.5～37.5 mN/m；而当pH值<4或pH值>9时，表面张力增加，强酸强碱影响表面活性剂的活性。但总的来说，菌株BS-8产生的表面活性剂有较宽的酸碱范围。

表2pH值对菌株BS-8产生的表面活性剂的稳定性的影响

pH值表面张力（mN/m）338.3436.9536.6636.8736.9836.8937.21038.31139.8

2.3.3表面活性剂在不同NaCl浓度下的稳定性将NaCl添加到含100 mg/L表面活性剂溶液中，使其成为一系列NaCl浓度梯度的溶液，保持2 h，测定各溶液的表面张力，结果如表3所示。表3表明，表面活性剂溶液的NaCl浓度在1%～6%之间，溶液表面张力的变化随盐度的变化很小，表面张力基本稳定在36.5～37.2 mN/m范围内，说明菌株BS-8产生的生物表面活性剂在NaCl浓度为1%～6%之间有较强的耐盐性；当NaCl浓度>6%时，表面张力增幅较大。

表3 不同盐度下菌株BS-8产生的表面活性剂的稳定性

NaCl浓度（%）表面张力（mN/m）136.6236.8336.7436.9536.8637.2738.2838.8940.2

3结论

菌株BS-8的表面活性剂产生方式为生长相关型，在培养6～30 h时，随菌体数量的迅速增加，表面张力从 63.2 mN/m 快速下降为39.4 mN/m；之后，菌体密度缓慢增长，表面张力持续下降但降速减慢。以葡萄糖为碳源培养菌株BS-8，培养液中含脂肽、脂蛋白类表面活性剂，从培养液中分离、纯化得到表面活性剂的产量为0.58 g/L，表面活性剂的CMC为90 mg/L。表面活性剂在pH值4～9、温度20～70 ℃、NaCl浓度1%～6%的范围内具有较强的稳定性。

参考文献：

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[7]冷凯良，楚晓珉，张辉珍，等. 微生物对石油烃降解代谢产物的分析方法研究[J]. 海洋水产研究，2001，22（2）：57-61.

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[10]郑新伟.一株生物表面活性剂产生菌的分离及其产物性质的研究[D]. 西安：西北大学，2011：31.