桥本甲状腺炎患者杀伤细胞免疫球蛋白样受体与人类白细胞抗原基因对频率的分析①

李建婷 郭 成 侯岩峰 焦玉莲 赵跃然 孙 慧 徐 进 曹铭锋 高 聆 赵家军 张海清 李明龙(山东大学附属省立医院内分泌科，济南250021)

杀伤细胞免疫球蛋白样受体(Killer cell immunoglobulin-like receptor，KIR)主要表达于自然杀伤细胞(Natural killer，NK)和部分T细胞表面，通过特异性识别靶细胞表面人类白细胞抗原(Human leukocyte antigen，HLA)，调控NK细胞和T细胞的免疫活性。HLA-C属于经典的HLA-I类分子，广泛分布于有核细胞表面，根据第80位氨基酸的不同，可将HLA-C分为HLA-C1(Asn80)和HLA-C2(Lys80)两组。HLA-C1组包括 HLA-Cw01、Cw03、Cw07、Cw08，特异性识别 KIR2DL2/3和 KIR2DS2;HLA-C2 组包括 HLA-Cw02、Cw04、Cw05、Cw06，特异性识别KIR2DL1和KIR2DS1。两组HLA-C配体分别与不同的KIR受体结合，影响机体自身的免疫稳态，导致疾病的发生［1-3］。

桥本甲状腺炎(Hashimoto's thyroiditis，HT)是自身免疫甲状腺病的一种，其发病机制可能与HT患者体内NK细胞和T细胞的免疫功能紊乱有关，但是具体机制尚未完全阐明。本研究旨在以往研究的基础上，用序列特异性引物PCR(sequence specific primer polymerase chain reaction，PCR-SSP)方法进一步分析KIR/HLA受体配体基因对的分布及其与HT发病间的关联性。

1 材料与方法

1.1 试剂与引物 Taq DNA聚合酶购自TaKaRa公司，dNTP购自上海生物工程技术服务有限公司。引物设计参照文献［4，5］，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

1.2 研究对象的选择 HT组选择2012年10月至2013年3月就诊于山东省立医院的山东地区桥本甲状腺炎患者44例，其中男1例，女43例，患者全部存在弥漫性甲状腺肿大，实验室检查见甲状腺过氧化物酶抗体(TPOAb)和甲状腺球蛋白抗体(TgAb)明显升高，甲状腺B超示符合桥本甲状腺炎表现，甲状腺细针穿刺细胞学检查结果确诊为HT，并排除其他甲状腺及自身免疫性疾病。对照组为同期同地区无血缘关系的随机健康个体43例，其中男1例，女42例，均排除甲状腺疾病、自身免疫性疾病及相关家族病病史。HT患者组与对照组的年龄、性别分布经检验无统计学差异。

1.3 基因组DNA提取 空腹抽取外周静脉血，ACD抗凝，用氯仿、饱和酚法提取DNA。

1.4 KIR基因分型分析 用序列特异性引物PCR方法进行KIR基因分型。测定的KIR基因包括抑制性 KIR:KIR2DL1、KIR2DL2/3，活化性 KIR:KIR2DS1、KIR2DS2以及框架基因 KIR2DL4。PCR反应体系20 μl，其中模板 DNA 100 ng，上、下游引物终浓度 0.2 μmol/L，10 × PCR buffer 2 μl，MgCl21.6 mmol/L，dNTP 0.25 mmol/L，Taq DNA 聚合酶0.5 U，加 ddH2O 至20 μl。反应条件:96℃预变性 1 min，循环参数:96℃ 变性 25 s，65℃ 退火 45 s，72℃延伸30 s，进行5个循环;96℃变性25 s，60℃退火45 s，72℃延伸30 s，进行21 个循环;96℃变性 25 s，55℃退火1 min，72℃延伸2 min，进行5个循环;最后72℃延伸10 min。PCR产物行1.5%琼脂糖凝胶电泳，Alpha Imager TM2200生物图像分析仪分析结果。每一个DNA模板的PCR扩增反应，以框架基因KIR2DL4作为PCR反应效率的内参照。

1.5 HLA-C基因分型分析 用序列特异性引物PCR方法进行HLA-C基因分型。测定的HLA-C基因为 HLA-Cw01-Cw08。PCR 反应体系20 μl，其中模板 DNA 100 ng，上下游引物终浓度 0.5 μmol/L，2 ×PCR buffer 10 μl，dNTP 0.25 mmol/L，Taq DNA 聚合酶 0.5 U，加 ddH2O 至 20 μl。反应条件:96℃预变性7 min，循环参数:96℃变性 30 s，68℃退火 45 s，72℃延伸60 s，进行 5个循环;96℃变性 30 s，63℃退火45 s，72℃延伸30 s，进行21个循环;96℃变性30 s，55℃退火 1 min，72℃ 延伸 2 min，进行 5 个循环;最后72℃延伸5 min。PCR产物处理同上。

1.6 统计学处理 应用SPSS18.0软件包处理，患者组与对照组之间KIR/HLA-C基因对频率显著性差异采用四格表卡方检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 KIR/HLA-C基因对频率在两组间的比较 分别比较HT患者组和健康对照组KIR2DL1+HLAC2、KIR2DL2/3+HLA-C1、KIR2DS1+HLA-C2 和KIR2DS2+HLA-C1四对KIR/HLA-C基因对的频率(图1)，四对基因对均以不同频率表达，与对照组相比，HT患者组外周血中KIR2DS2+HLA-C1基因对频率显著升高(36.36%vs 16.28%，P ＜0.05)，其余3对基因对 KIR2DL1+HLA-C2、KIR2DL2/3+HLA-C1和KIR2DS1+HLA-C2在HT组和对照组频率差异均无统计学意义。

2.2 各HLA-C基因频率在两组间的比较 分别比较 HLA-C1(HLA-Cw02、04、05、06)和 HLA-C2(HLA-Cw01、03、07、08)两组 HLA-C 基因，两组HLA-C基因在外周血中呈不平衡表达，其中HLACw03和HLA-Cw08基因在HT患者中频率较健康对照者减低，两组相比差异有显著性(15.91%vs 40.70%，26.14%vs 47.67%，P 均 ＜0.05)。但是总的HLA-C1和HLA-C2频率在两组间无显著性差异(表1)。

图1 4对基因对在两组人群中频率的差异性比较Fig.1 Frequencies of four KIR/HLA-C gene-pairs in HT patients in comparison with healthy controls

表1HLA-C1和HLA-C2基因频率比较Tab.1 Frequencies of HLA-C1 and HLA-C2 genes in patients compared with control subjects

3 讨论

近年来，关于KIR基因与疾病间关系的研究屡见不鲜，越来越多证据表明，特定的KIR基因型在肿瘤、病毒感染、妊娠流产及自身免疫性疾病的发生发展中起重要作用［6-9］。根据我们之前的研究，KIR多态性与HT的发病相关，其中抑制性KIR基因KIR2DL5可能是HT发病的保护因子［10］。但是随着研究的深入，研究者们发现在判断KIR生物学效应时，应同时分析其与HLA配体的配对情况，KIR只有通过与特异性HLA配体结合才能发挥对NK细胞和T细胞免疫活性的调节作用。例如，单独分析KIR频率时，黑色素瘤患者和1型糖尿病患者的KIR频率与正常人群相似;而分析KIR受体与HLA配体基因对时，发现黑色素瘤患者的抑制性KIR/HLA-C基因对频率较正常人群低［11］，1型糖尿病患者活化性基因对频率较正常人群高［12］。到目前为止，国内外有关HT患者KIR与HLA受体配体基因对的研究鲜有报道，因此，我们在以往研究的基础上，又延伸了对HT患者和健康对照人群KIR/HLAC受体配体基因对频率差别的研究。

我们应用PCR-SSP方法分析两组人群间4对不同KIR/HLA-C基因对频率的差别，结果显示只有活化性KIR2DS2/HLA-C1基因对频率在两组人群中有显著性差异，并且HT患者频率明显高于健康人群(36.36%vs 16.28%，P ＜ 0.05)，虽然 HLACw03和HLA-Cw08在两组间有统计学意义，但是总体HLA-C1和HLA-C2频率并没有统计学差异，不能作为判定HLA-C基因有意义的标准。以往Faridi等［8］应用PCR-SSP方法研究了早期复发性流产患者的KIR和HLA基因组合，发现复发性流产患者KIR2DL1/HLA-C2基因频率低于正常早孕妇女，而活化性KIR2DS2/HLA-C1基因频率则明显高于患者，表明抑制性和活化性KIR/HLA-C基因均可能与习惯性流产的发生有关。国内徐金娥等［13］做了类似的研究，结果发现只有活化性KIR2DS2/HLA-C1基因对频率在两组间有统计学意义，并且患者组频率高于对照组。Yen等［9］用同样的方法对类风湿性关节炎患者做了研究，发现患者KIR2DS2/HLA-C1基因对频率较健康对照者高。HT、习惯性流产和类风湿性关节炎的发生均与自身免疫功能异常相关，以上研究结果均提示抑制性和(或)活化性KIR/HLA-C基因对可能在自身免疫性疾病的发病中起作用。

对健康人而言，抑制性KIR/HLA受配体对可避免机体发生自身免疫性疾病，因此，抑制性受配体基因对所占比例平衡是维持机体免疫状态的重要条件，而活化性KIR/HLA受配体对主要增强机体免疫功能以抵抗病原体的入侵，但是它的活化作用往往异常，这又可能成为自身免疫性疾病的易感因素［14］。NK细胞和T细胞是机体重要的具有免疫功能的细胞，表达在NK细胞和部分T细胞表面的KIR受体，通过与特异性 HLA-C类分子结合，向NK/T细胞传递活化性或抑制性信号，调节NK/T细胞功能［15］。正常情况下，活化性受体和抑制性受体传递的两种信号总和平衡，使得NK/T细胞功能稳定，可耐受自身正常细胞［16，17］。如果活化性 KIR/HLA-C组合频率超过了抑制性受配体组合频率，NK/T细胞接受的活化性信号就多于抑制性信号，对靶细胞的杀伤作用就强，有可能对机体正常组织细胞进行攻击。相反，如果抑制性信号多于活化性信号，NK/T细胞的杀伤作用就会相对较弱，损伤靶细胞的能力相对减低，不会对机体正常细胞造成损伤［18］。

本研究结果显示，与健康人群相比，HT患者外周血活化性KIR2DS2/HLA-C1基因对频率增加，可能通过影响活化性与抑制性KIR/HLA-C受配体对之间的平衡，使NK/T细胞的激活阈值下降，易于被自身抗原激活，破坏机体的免疫稳定状态，异常激活的NK/T细胞可直接杀伤自身甲状腺细胞造成甲状腺组织过度破坏，导致HT相关临床症状的发生。现已证实，CD4+辅助性 T细胞(T helper，Th)的Th1型细胞因子介导的细胞免疫在HT发病中起主导作用［19，20］，异常激活的 NK/T细胞也可分泌 TNF-α、IFN-γ等Th1细胞因子从而间接诱导甲状腺细胞凋亡，导致自身甲状腺组织破坏，致使HT的发生。

综上所述，HT患者外周血中KIR2DS2/HLA-C1基因对频率增高，使NK/T细胞功能异常导致机体自身免疫功能紊乱，可能是引起HT发病的免疫遗传学因素之一。对KIR/HLA-C基因对的分析为研究HT的发病机制提供了新的方法，为今后桥本甲状腺炎的早期诊断早期治疗开辟新的思路。但是有关KIR、HLA-C基因在mRNA、蛋白等表达水平的研究仍不完善，有待今后进一步深入的研究。

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