间充质干细胞临床应用的安全性问题

武艳++++++曹雅男++++++刘洁婷++++++袁晓环++++++腾云

[摘要] 间充质干细胞是干细胞家族的重要成员，起源于中胚层和外胚层，因其具有易分离、趋化性、免疫调节作用、多向分化潜能等生物学特性而日益受到人们的关注，并成为细胞疗法中治疗各种难治性疾病的热门种子细胞，然而细胞疗法所涉及的潜在风险还不确定。本文就间充质干细胞应用所涉及的安全性问题作综述，并强调建立规范化的应用标准更有利于细胞产品在临床上的应用和推广，给广大患者带来真正的福音。

[关键词] 间充质干细胞；细胞疗法；安全性

[中图分类号] R457.7 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721（2014）11（b）-0190-03

细胞疗法近年来已成为治疗多种疾病的新策略，其目的是替代修复或加强受损组织和器官的生物学功能。随着干细胞生物学与再生医学研究的深入，人们对于其生物学特性及潜在的临床应用认识逐渐加深，使之成为细胞疗法中应用最多的靶细胞[1-3]。随着对间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）认识的逐步深入，其自身的优越性逐渐显露出来，将成为细胞替代治疗的理想种子细胞。对于MSCs研究的某些成果已开始应用于临床，有一些虽然暂时未能在临床上开展，但也为有些疾病的临床治疗提供了新的治疗角度和思路。对于MSCs治疗作用的评估最开始是在再生医学的应用上，MSCs已经显示出具有直接调节先天性与适应性免疫系统的作用[4]、促进上皮细胞增殖[5]、促进缺血性组织的血管再生等等[6]，MSCs的这些特性发现开启了MSCs移植治疗免疫性、组织损伤性等疾病的新纪元。

近年来，对一些难治性疾病采用MSCs移植治疗已经得到美国食品和药物管理局（US-FDA）的批准，包括心肌梗死、脑卒中、半月板损伤、移植物抗宿主病及自身免疫紊乱性疾病等[7]。尽管在过去的十几年中，临床试验很少发现MSCs移植会产生不利的影响，但在动物实验则发现可能存在较短时间内未发现潜在性的危害，本文将MSCs移植涉及的安全性问题作总结。

MSCs移植方法的过程包括细胞的采集、分离、培养、纯化以及细胞移植到患者体内。临床应用干细胞治疗疾病最重要的前提之一就是必须保证细胞产品的安全性、有效性和质量可控性，其中质量可控性是安全性和有效性的基础和保证。那么，如何保证用于临床的干细胞是安全、有效，并保证质量可控呢？对于这些细胞的分离、培养、鉴定和移植有可靠的履行规则吗？目前，在欧洲国家已经开始提出使用临床级的MSCs产品，并且开始制订包括无菌、细胞活力和染色体表型等的各种质控标准。细胞治疗的过程非常复杂，有许多基本的生物学问题需要弄清楚。事实上，MSCs移植的应用不仅面临其他细胞疗法共同的安全性问题，也面临其所独有的问题。

1 细胞的分离、培养和纯化

虽然来源于骨髓比来源于其他组织的MSCs的数量相对更多，但MSCs的数量仅占骨髓总量的0.001%～0.01%[8]，很难满足临床细胞治疗的需要，因此需要培育大量的MSCs来满足其应用，但在MSCs的分离、培养、细胞增殖传代的过程中有许多问题需要考虑。

干细胞组织来源多样，供者的既往病史、家族史、性别、年龄、血型、组织相容性抗原等遗传背景都需要考虑。在进行自体移植收集细胞的时候，也需要对患者的整体状况作评估。提取细胞的手术可能会损伤患有感染、肾脏疾病、心包积液等禁忌证患者的健康。对于细胞产品本身来说，确保其无菌状态是细胞疗法的一个首要问题，因为细胞产品不能像其他药品那样有一个终端灭菌消毒的过程，因此全程操作必须在无菌条件下进行[9]。在收集细胞之前，所有的肠道外用药和医疗器械都需高温消毒，一次性物品也要进行消毒处理，并行有氧和厌氧菌及真菌微生物检测，以保证细胞无菌且不会给患者带来伤害。

另外，培养条件对于维持细胞的特性也非常重要。细胞的体外分离、培养、扩增和细胞制品制备过程的漫长且需要加入血清、抗生素、生长因子、抗体、胶原酶、蛋白酶等物质，外来物质的污染也不可避免，在此过程中，以加入的血清为例，目前细胞培养的培养基需要加入10%～20%的胎牛血清（fetal bovine serum，FBS或fetal calf serum，FCS），虽然FBS或FCS似乎是获得高质量MSCs必不可少的，但其能带来潜在的危险，甚至在移植入患者体内后引起免疫反应[10-11]，包括传播具有免疫原性的异种蛋白和致病原等[12]，而使MSCs移植的疗效大大降低[13]。因此，在细胞培养过程中，寻找FBS/FCS的替代物或采用无血清培养，取消非人产品的使用来降低潜在的风险是有必要的[14]。Doucet等[15]已经发现在体外培养MSCs时，采用血小板血浆培养细胞维持MSCs分化能力比FCS的效果更好。其他外来因素包括细菌、支原体、病毒等也会影响细胞产品的应用。对于病毒来说，最主要的来源是供体的骨髓，因此对于供体的血清学检测分析是否存在人类免疫缺陷病毒、人类T淋巴细胞病毒、肝炎病毒等非常必要[16]。另外还有一个重要的问题需要注意，许多病毒的潜伏期很长，这也就意味着其潜在的风险在整个过程中无法完全消除。

在体外的操作过程中，细胞的特性包括生物学功能、端粒酶、核型、组织相容性抗原、原癌抑癌基因、增殖能力、分化潜能等可能发生改变并带来免疫毒性和致瘤风险。细胞培养、保存、运输、复苏、配制的过程时间较长，细胞制品的存活率、生物学功能、均一性无时不在变化，难以保证MSCs临床应用的安全、有效，甚至在MSCs的早期传代细胞也会发生染色体异常[17]，这就意味着在MSCs移植之前其特性应被监测以保证应用的安全性。

2 细胞的贮存

一般来说，制备最终细胞产品在应用之前都是冷藏贮存在细胞库中。细胞产品的半衰期很短[18]，许多细胞制品在给患者移植之前其效能就已经发生了变化，因此这需要考虑细胞的一致性和细胞的稳定性。对于细胞的一致性来说，干细胞受不同供体的影响，包括年龄、性别、身体状况等，细胞的来源不同，细胞的增长率、细胞的分化能力、染色体的稳定性、移植入体内的活性等也会不同[19]，如供体的年龄较大，则MSCs老化会更快，其生物学活性也会较差。每一批次来源于不用供体的细胞在治疗时也应考虑人类白细胞抗原的配型，因为异源细胞移植最大的障碍就是免疫排斥现象。细胞稳定性也是需要注意的问题，细胞产品不同于传统药物，因为其是一种“活的”物质，受到来源、培养过程及贮存的限制，所以在细胞移植之前需要检测细胞的稳定性包括关键基因的表达、染色体的稳定性和表观遗传学的稳定性（甲基化、miRNA、组蛋白乙酰化和X染色体的失活）等。endprint

3 细胞的移植

一般来说细胞移植主要包括两种方法。①局部移植：在损伤部位采取单点或多点局部直接注射；②静脉移植：将MSCs经静脉注射以到达损伤部位。然而，在临床上采用MSCs移植治疗无法确定细胞的剂量保证其有效性[20]，这需要在基础和临床研究中进一步探讨。另外，细胞移植还可能存在免疫抑制、刺激恶性肿瘤的生长以及细胞的病态分化等问题[21]。

采取不同的移植方法可能引起不同的移植问题，将MSCs局部移植到损伤部位可能引起局部的病理反应，而静脉移植可能引起更大的反应，如移植的细胞可能并没有进入损伤部位而是流到了机体的主要器官[22-23]，包括肺脏、心脏、脾脏、肾脏、肝脏等，这样就影响了其治疗效果。MSCs的低免疫原性使其在治疗难治性自身免疫性疾病中开辟了一个新的治疗方法，但这种低免疫原性也会引起产品的安全性问题。MSCs的移植可能逃避免疫监视，使受体更容易受到机会性感染。如果移植的细胞中含有肿瘤细胞，那么MSCs就可能变为肿瘤相关的表型而通过直接或间接促进肿瘤细胞的生长、转移或血管生成而支持肿瘤的生长[24]，尽管还不清楚MSCs是否通过免疫调节、营养还是其他的原因而促进了肿瘤细胞的生长。有些患有如糖尿病、类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮和多发性硬化病等疾病的患者，不能采用自体干细胞移植，需要异源的干细胞进行治疗，但当异源的MSCs移植入体内，MSCs有可能被机体认为是外来物质，而产生排斥反应，这样不仅不能起治疗效果，而且可能给患者造成严重的危害。

将MSCs移植到一个本来不属于其的地方，是有一定潜在的风险。人们已日益认识到具有“干性”特征的细胞几乎存在于所有类型的组织，如神经系统、骨髓、外周血、脂肪组织、皮肤等。在过去的几十年中，随着干细胞领域的蓬勃发展，发现这些具有“干性”特征的细胞可以根据不同微环境的影响而发生不同的分化。细胞移植是从原来的微环境转移到了一个新的环境。在新环境中的干细胞可能分化为理想的细胞，但这些有“干性”的细胞也可能形成肿瘤或分化为损伤修复不需要的细胞[25]，甚至细胞的聚集位置也不确定。移植MSCs后，当Wnt信号通路被抑制，MSCs有转化为肉瘤的潜能。这并不奇怪，因为在微环境作用和病理情况变化下，来源于非损伤组织的MSCs会继续其自然发育趋势产生非损伤组织的物质，从而产生肿瘤，所以，在干细胞移植的应用中，应注意避免这些问题，但遗憾的是，现在许多难治性疾病在传统治疗失效的情况下，不得不采取细胞疗法。

综上所述，在细胞疗法的临床应用中，需要考虑其安全性的问题。对于这些安全性的隐患其根本原因在于医疗机构个体化治疗受制于人员技能、场所、时间等，造成误差累积，也难以满足大规模临床需求；采集、采购、建库、制备、保存、检测、评价、传输、回输需要社会专业化分工完成；工艺路线及注射液处方设计不合理，未通过极限挑战考察；干细胞制品开发需要通过系统化、科学化的研究，质量研究应与动物实验、临床实验有机结合起来，进行全方位、全过程质量控制。人类对干细胞的认识尚处幼稚阶段，作用靶点和机制不清、体内转归不明、移植后持续不良反应无法终止、长期植入后果不确定、法规和技术标准缺位，因此干细胞滥用必然会带来灾难性的后果，尤其是在发展中国家，这种现象更为普遍。相关监管部门应建立健全一套细胞疗法的标准和准则，消除存在的安全隐患，期盼干细胞移植在经历基础和临床实验后能真正应用于临床治疗，为患者带来福音。

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（收稿日期：2014-09-26 本文编辑：李亚聪）endprint