牦牛肉及脂肪中β-胡萝卜素含量测定

苟锐锋，柴沙驼，高丹，王树林，，*

（1.青海大学农牧学院，青海西宁810016；2.青海大学畜牧兽医科学院，青海西宁810016）

β-胡萝卜素（β-C）是存在于植物体内的脂溶性维生素，人与动物都无法合成。β-胡萝卜素在动物体内是维生素 A（VA）的主要来源[1-3]，VA及其衍生物（视黄酸和视黄醛）不仅可维持动物和人的正常视力[4]，且在细胞分化、发育和增殖等方面起重要作用，但动物和人的机体不能合成VA，只能直接通过VA制剂或间接通过食物中的类胡萝卜素降解而获得。

一般动物组织对β-胡萝卜素在内的类胡萝卜素的富集并不十分明显，正常的动物组织并不表现出黄色，但有些动物的脂肪及其他组织表现出明显的类胡萝卜素富集能力，许多品种的家禽脂肪具有明显的黄色，在禽类肉品质评价中这种特点并不是一种缺陷。许多水生动物的组织具有类胡萝卜素的富集能力，例如许多观赏鱼类具有的鲜艳颜色与类胡萝卜素在肌肉及其他组织中的富集有关[5]。动物各组织在富集β-胡萝卜素存在差异，肝脏是主要的β-胡萝卜素富集和代谢组织，此外，性别也会影响组织对β-胡萝卜素的吸收，例如，ReynosoCR等研究表明，母牛脂肪组织中β-胡萝卜素的含量（42μg/100g）远高于公牛（26μg/100g）[6]。大多数家畜的肌肉和脂肪对类胡萝卜素并没有明显的富集能力，这是大多数家畜的脂肪表现为白色的原因，也是正常家畜肉品质所必须具有的特征，在非正常情况下（例如遗传缺陷及病理原因）家畜脂肪的黄色被认为是一种品质缺陷，这种现象并不十分普遍。但牦牛肉的脂肪具有明显的黄色，且这种黄色随季节及营养变化而发生改变，在牦牛肉品质评价中这种特点不能简单地定义为是一种缺陷。牦牛脂肪的黄色与牦牛脂肪高效富集类胡萝卜素化合物直接相关，但关于牦牛组织富集类胡萝卜素的机理及其对维生素代谢的影响缺乏研究。

牦牛组织中类胡萝卜素含量的测定是开展以上研究的基础。测定动物组织的β-胡萝卜素，首先要对组织中的β-胡萝卜素要进行提取，提取工艺是否合理，溶剂选择是否恰当，直接关系到测定结果。常用的提取方法有：有机溶剂提取法、酶反应法、微波辅助提取法、超声波辅助提取法、超临界流体萃取法等[7]。β-胡萝卜素的测定方法一般是用有机溶剂将β-胡萝卜素提取到有机相，脂肪含量大的样品进行皂化，再萃取其不皂化物，经过柱层析或纸层析将β-胡萝卜素分离，分光光度法定量，或用高效液相色谱法分离定量[1]。

目前鲜见对牦牛组织中类胡萝卜素系统测定的研究报道，本试验中采用氨水皂化，石油醚为溶剂对牦牛肉及脂肪β-胡萝卜素进行萃取，利用正交试验优化提取工艺，以期为牦牛组织中类胡萝卜素的代谢机理研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

试验材料：牦牛肌肉，牦牛脂肪。

试剂：浓氨水（25%～28%）、乙醇（99.7%）、石油醚：天津市富宇精细化工有限公司；β-胡萝卜素标准品（99.5%，Fluka公司）均为分析纯。

1.2 仪器与设备

UV-2600岛津紫外可见分光光度计：岛津制作所；JM-B2003电子天平：余姚纪铭称重校验设备有限公司；THZ-82恒温振荡器：国华企业；800型离心沉淀器：上海手术机械十厂；DHG-9070A电热鼓风干燥箱：上海一恒科学仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 牦牛肉及脂肪中β-胡萝卜素的提取工艺流程

称取5 g样品，加入一定量石英砂进行研磨，使组织得到充分破碎，分别加氨水5 mL，乙醇35 mL，摇匀，在40℃下皂化60 min，取出后进行过滤弃去滤液得非皂化物[1]。按料液比为1∶15（g/mL）将非皂化物用75 mL的石油醚在50℃下浸提120 min，过滤得提取液，抽滤得样品备用。工艺流程如图1所示。

图1 牦牛组织中β-胡萝卜素提取工艺流程图Fig.1 The process diagram of β-carotene extracting in yak tissues

1.3.2 β-胡萝卜素含量测定方法

β-胡萝卜素标准品的全波长扫描图如图2所示。

图2 β-胡萝卜素标准品的全波长扫描图Fig.2 The full wavelength scanning diagram of β-carotene standard

β-胡萝卜素在428、450、478 nm处具有特征吸收峰，450 nm处为最大吸收峰，因此以450 nm作为样品检测波长[8]。将提取物用石油醚定容到50 mL的容量瓶，用石油醚作参比，在450 nm处测吸光度值[9-10]。

1.3.3 β-胡萝卜素标准曲线及组织中β-胡萝卜素含量的计算

精确称取β-胡萝卜素标准品5 mg，用石油醚定容至50mL，其浓度为0.1mg/mL。取5个试管，分别取3、6、9、12、15 mL 标准品母液并定容到 50 mL，在 450 nm处测定吸收峰值并绘制出标准曲线，标准曲线如图3所示。标准曲线方程为y=3. 2833x+0. 0185（R2=0. 9912）。

在450 nm处测定样品吸光度值，根据标准曲线计算样品溶液中β-胡萝卜素的浓度，按以下公式计算样品中β-胡萝卜素的表观含量[11]。

式中：c为样品提取物定容后β-胡萝卜素的浓度，（mg/mL）；v为样品提取物定容的体积，mL；m 为称取样品的质量，g。

图3 β-胡萝卜素标准曲线Fig.3 The standard curve of β-carotene

1.3.4 皂化条件的单因素试验设计

研究皂化温度及时间对提取效果的影响。

1.3.4.1 不同皂化温度的影响

分别在 30、40、50、60 ℃温度下皂化 1 h，然后将非皂化物按1∶15的料液比在50℃下萃取2 h，过滤，浓缩，定容到50 mL的容量瓶，在450 nm处测吸光度值。

1.3.4.2 不同皂化时间的影响

在40℃分别皂化0.5、1、1.5 h，然后将非皂化物按1∶15（g/mL）的料液比在 50 ℃下萃取 2 h，过滤、浓缩、定容到50 mL的容量瓶，在450 nm处测吸光度值。

1.3.5 牦牛肉及脂肪β-胡萝卜素萃取的正交试验设计

β-胡萝卜素萃取的正交试验选择萃取温度、萃取时间、料液比3个因素，每个因素3个水平[12-13]，因素水平见表1。以β-胡萝卜素提取液的吸光度值和提取率为考察指标，用L9（34）正交表安排试验。

表1 β-胡萝卜素萃取的正交试验因素-水平表Table 1 The orthogonal experiment factors-levels table of βcarotene extracting

2 结果与讨论

2.1 单因素试验结果及分析

2.1.1 皂化温度对提取效果的影响

β-胡萝卜素为脂溶性维生素，对于脂肪含量高的样品需对其进行皂化[14]，因为当脂肪含量较高时β-胡萝卜素大部分溶解在脂肪中，进行萃取时，β-胡萝卜素很难进入萃取液，影响试验结果。而进行皂化可以使脂肪水解为游离的脂肪酸使β-胡萝卜素释放出来，提高萃取率[10]。皂化温度对提取效果的影响如图4所示。

图4 皂化温度对β-胡萝卜素提取效果的影响Fig.4 Effect of saponification temperature on extracting of βcarotene

由图4可知，在其他条件一定时，随着皂化温度的增加，样品表观含量增加，当皂化温度为40℃时，测得的含量最高。继续增加皂化温度，提取效果反而变差，造成提取效果变差的原因可能是β-胡萝卜素对热不稳定，随着温度升高部分β-胡萝卜素分解[10]。故选择最适的皂化温度为40℃。

2.1.2 皂化时间对提取效果的影响

皂化时间对提取效果的影响如图5所示。

图5 皂化时间对β-胡萝卜素提取效果的影响Fig.5 Effect of saponification time on extracting of β-carotene

由图5可知，在其他条件一定时，随着皂化时间的延长，提取率逐渐增加，在皂化时间为1 h时，提取率最高。皂化时间超过1 h，随着皂化时间增加，提取率反而下降。这是因为皂化时间过短，皂化不完全，不能将全部脂肪水解为游离的脂肪酸，时间太长，部分β-胡萝卜素会溶解在皂化系统溶液里[10]，故选择最适的皂化时间为1 h。

2.2 正交试验结果及分析

2.2.1 萃取牦牛脂肪β-胡萝卜素正交试验结果

牦牛脂肪中β-胡萝卜素萃取条件的正交试验结果及极差分析结果见表2。

由表 2 可见，料液比的平均值 k2＞k3＞k1，萃取温度平均值 k3＞k2＞k1，萃取时间平均值 k2＞k3＞k1。因此最佳萃取组合为 A2B3C2，即料液比为 1∶15（g/mL），萃取温度为60℃，萃取时间为1.5 h。料液比、萃取温度、萃取时间3个因素的极差分别为10.60、7.10、6.05。表明料液比对β-胡萝卜素提取效果影响最大，各因素对β-胡萝卜素提取效果影响的主次为：料液比＞萃取温度＞萃取时间。

表2 正交试验结果及极差分析Table 2 Results of orthogonal experiment and analysis

2.2.2 萃取牦牛肉β-胡萝卜素正交试验

牦牛肉中β-胡萝卜素萃取条件的正交试验结果及极差分析结果见表3。

表3 正交试验结果及极差分析Table 3 Results of orthogonal experiment and analysis

由表 3 可知，料液比平均值 k2＞k1＞k3，萃取温度平均值 k3＞k2＞k1，萃取时间平均值 k1＞k3＞k2。因此最佳萃取组合为 A2B3C1，即料液比为 1∶15（g/mL），萃取温度为60℃，萃取时间为1 h。料液比﹑萃取温度、萃取时间3个因素的极差分别为0.54、1.24、1.16。表明萃取温度对牦牛肉β-胡萝卜素提取效果影响最大，各因素对β-胡萝卜素提取效果影响的主次为：萃取温度＞萃取时间＞料液比。

2.2.3 验证试验及样品测定结果

根据表2确定的最优组合A2B3C2，在该条件下测得牦牛脂肪中β-胡萝卜素含量为29.05 mg/100 g，其含量小于表2中的5号试验30.53 mg/100 g，故综合考虑得牦牛脂肪中β-胡萝卜素萃取的最佳条件为A2B2C3，即料液比为 1∶15（g/mL），萃取温度为 50 ℃，萃取时间为2 h，并且在该条件下进行验证试验得到牦牛脂肪中β-胡萝卜素的含量为30.60 mg/100 g。

根据表3得到的最优组合A2B3C1，即表3的6号试验，在该条件下测得其牦牛肉中β-胡萝卜素的含量为5.61 mg/100 g，在该条件下进行验证试验得到牦牛肉中β-胡萝卜素的含量为5.70 mg/100 g。故牦牛肉中β-胡萝卜素萃取的最佳条件为A2B3C1，即料液比为1∶15（g/mL），萃取温度为 60 ℃，萃取时间为 1 h，牦牛肉中的含量为5.70 mg/100 g。

肉牛脂肪内β-胡萝卜素的浓度为0.99 μg/g，肌肉内β-胡萝卜素的浓度为0.16 μg/g[6]。由此可见牦牛无论脂肪或者肌肉其β-胡萝卜素的含量均高于一般牛肉。

3 结论

通过正交试验优化了牦牛肉及脂肪中β-胡萝卜素的提取工艺。牦牛脂肪中β-胡萝卜素提取最佳工艺条件为：在 40 ℃下皂化 1 h，料液比为 1∶15（g/mL），萃取温度为50℃，萃取时间为2 h。牦牛肉中的β-胡萝卜素提取最佳工艺条件为：料液比为1∶15（g/mL），萃取温度为60℃，萃取时间为1 h；试验结果表明，牦牛的不同部位所含β-胡萝卜素的量不同，牦牛脂肪中β-胡萝卜素的含量为30.60 mg/100 g，牦牛肉中β-胡萝卜素的含量为5.70 mg/100 g；试验结果表明，牦牛组织中β-胡萝卜素的含量远高于一般牛脂肪。

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