几种雅罗鱼亚科鱼类基于mtDNA 序列的亲缘关系

窦新杰， 常玉梅， 唐 然， 陶 然，3， 梁利群

(1.淡水鱼类育种国家地方联合工程实验室，农业部淡水水产生物技术与遗传育种重点实验室，中国水产科学研究院黑龙江水产研究所，黑龙江 哈尔滨150070;2.上海海洋大学水产与生命学院，上海201306;3.宁波大学海洋学院，浙江 宁波315211)

雅罗鱼亚科(Leuciscinae)隶属于鲤形目(Cyprinoidei)鲤科(Cyprinidae)，在中国南北方均有分布，其中北方主要以雅罗鱼属(Leuciscus cuvier)为主［1-2］。雅罗鱼属约有20 种［1］，在中国有7 种，其中瓦氏雅罗鱼(L.waleckii)主要分布于黑龙江流域包括呼伦湖、黑龙江、松花江、乌苏里江，此外在达里湖、岱海滦河、黄河、辽河以及俄罗斯境内的黑龙江上游江段也有少量分布;图们雅罗鱼(L.waleckii tumensisMori)分布于图们江;准噶尔雅罗鱼(Leuciscus merzbacheri)分布于准噶尔盆地;高体雅罗鱼(L.idus)和贝加尔雅罗鱼(L.leuciscus baicalebsis)主要分布在中国新疆额尔齐斯河水系。滩头雅罗鱼(Tribolodon branditDybowski)和珠星雅罗鱼(L.haronensisGunther)也主要分布在中国北方绥芬河和图们江流域［3-4］，并且有海边(半咸水区)溯河产卵现象。这些种类在分布区是具有重要经济价值的鱼类。

雅罗鱼亚科的鱼类具有对不良环境超强的适应性。如瓦氏雅罗鱼能够在pH 9.6，碱度高达50 mmol/L的高盐碱湖泊-达里湖中生存［5-8］，而珠星雅罗鱼能够在pH3.5 的酸性湖泊-日本宇曾利山湖中存活［9］。那么，对当地环境的适应是否造成不同种群遗传结构发生变异，以及这种变异是否导致不同种群进化成不同的物种?池炳杰等［10］利用微卫星标记检测了瓦氏雅罗鱼淡水群体和碱水群体的遗传组成，发现2 个群体出现了明显的遗传分化，进一步深入研究发现，除有限的基因交流造成的地域种群分化外，由环境因子(如碱度)诱发的自然选择作用也是导致不同群体分化的主要进化力量［11］。此外，滩头雅罗鱼和珠星雅罗鱼由于生活环境的不同(海水或酸性水)，有些学者依据表型和遗传数据将这2 个种划分为3 块鱼属而非雅罗鱼属［12］。刘金亮等［13］利用微卫星标记估算了4 个雅罗鱼种5 个不同群体的遗传距离，发现贝加尔雅罗鱼和高体雅罗鱼遗传距离小，聚为一类，并与滩头雅罗鱼的遗传距离较近;瓦氏雅罗鱼的达里湖群体和松花江群体遗传距离小，聚为另一类。

动物线粒体DNA(mtDNA)结构相对简单，在进化过程中与核基因平行进化，属于母系遗传，具有进化速率快，不易发生重组等特点，是目前分析群体遗传结构、种间遗传分化以及种属亲缘关系鉴定的重要工具［14-15］。本研究选择mtDNA 的COI、Cytb和Dloop3 个基因，对瓦氏雅罗鱼的2 个地理群体(松花江雅罗鱼和达里湖雅罗鱼)、高体雅罗鱼、贝加尔雅罗鱼、滩头雅罗鱼和珠星雅罗鱼进行遗传多样性分析，探究这几种鱼类之间的系统发育关系，为进一步探讨雅罗鱼亚科系统发育关系以及种属划分提供基础资料。

1 材料与方法

1.1 材料

本研究共收集到雅罗鱼亚科隶属于2 个属的6个种群样本(表1)。其中雅罗鱼属包括瓦氏雅罗鱼的2 个地理群体(松花江群体，SHJ;达里湖群体，DL)、高体雅罗鱼(GT)和贝加尔雅罗鱼(BJ);三块鱼属包括滩头雅罗鱼(TT)和珠星雅罗鱼(ZX)。样本采集地分别是松花江绥滨段、内蒙古达里湖、新疆额尔齐斯河、新疆赛里木湖、黑龙江绥芬河、日本宇曾利山湖(Kaneko 教授惠赠)。所有样本鳍条于95%酒精中保存备用。

表1 6 个雅罗鱼群体的样本信息Table 1 Sampling information of six populations

1.2 基因组DNA 的提取及PCR 扩增

基因组DNA 的提取方法为常规的酚-氯仿法，具体步骤参照刘金亮等［13］的方法。COI和D-loop引物［16-17］适用于所有样本，而参照孔庆鹏等的Cytb引物［18］仅适用于雅罗鱼属。因此，根据NCBI 上已公布的滩头雅罗鱼的Cytb序列，利用软件Primer 5.0 设计1 对引物，引物序列见表2。PCR 反应体系为50 μl，包括35 μl 自制混合Buffer(包括50.0 mmol/L KCl、10.0 mmol/L Tris-HCl、0.10% TritonX-100、1.5 mmol/L MgCl2、0.10% NP-40、0.01%明胶、4 种dNTP)，浓度为10.0 mmol/L上、下游引物各0.75 μl，50 ng 的基因组2 μl，TaqDNA 聚合酶1U(Fermentas)、去离子无菌水补至总体积50 μl。PCR反应条件为:94 ℃预变性5 min;35 个循环包括94℃30 s，55 ℃或52 ℃30 s(表2)，72 ℃1 min;最后72 ℃延伸10 min。PCR 扩增产物用1.5%的琼脂糖凝胶电泳检测后，送至上海立菲生物技术有限公司完成测序。

表2 COI、Cytb 和D-loop 的PCR 引物信息Table 2 Information of PCR primers for three regions of mtDNA

1.3 序列处理及分析

利用Clustalx1.8 和Bioedit7.0 分别对COI、Cytb和D-loopmtDNA 基因序列进行多重比对、校正。利用MEGA5.1 计算序列4 种核苷酸组成比例、碱基转换∕碱基颠换值(R)，基于Kimura 双参数模型计算种间遗传距离，用邻接法(Neighbor-joining method，NJ 法)构建系统发育进化树，Bootstrap (重复1 000 次)检验系统树各分支的置信度。利用DNAsp5.0 计算多态位点数(S)、单倍型数(H)、单倍型多样性(Hd)、核苷酸多样(Pi)以及平均核苷酸差异数(K)。利用Arlequin3.1 进行种内及种间的分子方差分析(AMOVA)。

2 结果

2.1 COI 基因多样性

序列经比对校正后，得到COI部分的有效序列长度为635 bp。COI基因在6 个种群中共分析了39 条有效序列。核苷酸组成分析结果显示，腺嘌呤(A )、胸腺嘧啶(T)、鸟嘌呤(G)、胞嘧啶(C)4 种碱基的平 均 含 量 依 次 为24.53%、28.13%、19.05% 和18.19%，A + T 含量(52.70%)略高于G + C 含量(47.3%)，碱基转换与碱基颠换比(R)为3.394。单倍型分析显示，所有样本共有16 个单倍型，其中DL和SHJ 共享单倍型且数量为2 个;GT 和ZX 各独享1个单倍型(表3)。遗传多样性参数统计显示，贝加尔雅罗鱼(BJ)和滩头雅罗鱼(TT)的遗传多样性最高，其次为瓦氏雅罗鱼的DL 和SHJ 群体，高体雅罗鱼(GT)和珠星雅罗鱼(ZX)未检测到遗传变异(表3)。

2.2 Cytb 和D-loop 基因多样性

由于Cytb和D-loop分析的样本相同，因此将这2个基因序列整合为1 个长度为1 095 bp 的片断(Cytb-D-loop)，共分析了39 条有效序列。核苷酸组成分析结果显示，A、T、G 和C 4 种碱基的平均含量分别为27.93%、31.21%、15.90% 和24.96%，A + T 含 量(59.14%)明显高于G+C 含量(40.86%)，碱基转换与碱基颠换比(R)为3.27。所有样本共检测到34 个单倍型，其中贝加尔雅罗鱼(BJ)享有单倍型数最多为11 个;珠星雅罗鱼(ZX)享有的单倍型数最少为3个，其余种群的单倍型数为4 ～6 个(表4)。遗传多样性分析结果显示，6 个种群的各项遗传多样性参数普遍较高，其中，贝加尔湖雅罗鱼(BJ)和高体雅罗鱼(GT)各项参数值比较接近;瓦氏雅罗鱼的DL 和SHJ群体的遗传多样性相近，而滩头雅罗鱼(TT)与珠星雅罗鱼(ZX)数值差异大(表4)。

表3 6 个雅罗鱼种群COI 基因的遗传多样性Table 3 Genetic diversity of six populations based on COI gene

表4 6 个雅罗鱼种群Cytb-D-loop 基因的遗传多样性Table 4 Genetic diversity of Cytb-D-loop gene of six populations

2.3 群体遗传结构分析

图1 基于COI 基因的种间遗传距离构建的系统发育树Fig.1 Phylogenetic tree constructed with COI gene mtDNA

以Kimura 为双参数模型计算6 个雅罗鱼种群间的遗传距离。基于COI基因的遗传距离显示，6个种群聚为2 大分支，其中SHJ、DL、GT 和BJ 亲缘关系较近，聚为一支，而TT 和ZX 聚为另一支(图1)，该聚类支持6 个种群分属2 个属，即雅罗鱼属和三块鱼属。在雅罗鱼属的4 个种群中，瓦氏雅罗鱼的2 个群体的遗传距离最近为0.002，GT 与BJ 之间的距离为0.072，分别与SHJ 和DL 的遗传距离介于0.068 ～0.082;三块鱼属中的TT 和ZX 2 个物种的遗传距离为0.045，与另外4 个种群间的距离介于0.137 ～0.161(表5)。基于Cytb-D-loop基因的亲缘关系聚类结果显示，ZX 单独聚为一支，且与另外5 个种群间的遗传距离较远，介于0.170 ～0.283(表5);除此之外，其他种群的聚类结果与COI相似(图2)。

种群遗传分化指数分析显示，瓦氏雅罗鱼种内的2 个地理群体在COI和Cytb-D-loop2 个mtDNA区段均没有出现明显的遗传分化(P＞0.05)，而不同种间相比，6 个种群在COI和Cytb-D-loop区段出现了不同程度的遗传分化(P＜0.05)(表5)。对6个种群的遗传结构按照种属关系进行2 个层次的分子生物学方差分析。其中，按照雅罗鱼属(SHJ、DL、GT、BJ)和三块鱼属(TT、ZX)2 个属划分，组间遗传结构有明显分歧(P＜0.05);按照瓦氏雅罗鱼(SHJ、DL)、高体雅罗鱼、贝加尔雅罗鱼、滩头雅罗鱼和珠星雅罗鱼5 个种划分，组间差异不显著(P＞0.05)。

表5 基于COI 和Cytb-D-loop 基因的6 个雅罗鱼种群间的遗传分化指数和遗传距离Table 5 The genetic differentiation index and genetic distance among six poputations based on COI and Cytb-D-loop genes

图2 基于Cytb-D-loop 基因的种间遗传距离构建的系统发育树Fig.2 Phylogenetic tree constructed with Cytb-D-loop gene mtDNA

2.4 种群特异位点的鉴定

对6 个种群所特有的多态位点数进行统计，没有找到能够区分瓦氏雅罗鱼2 个地理群体的特异位点，因此按照5 个种群进行统计，在COI和Cytb-Dloop2 个区段均发现了多个种群特异位点，其中，珠星雅罗鱼拥有的特异位点数最多(53 个)，依次为瓦氏雅罗鱼(47 个)、贝加尔雅罗鱼(31 个)、滩头雅罗鱼(27 个)和高体雅罗鱼(22 个)(表6)。

表6 基于COI 和Cytb-D-loop 基因的6 个雅罗鱼种群的特异位点数Table 6 The specific loci on COI 和Cytb-D-loop genes of mtDNA differentiating six populations

3 讨论

3.1 群体的遗传多样性

基于6 个种群的COI和Cytb-D-loop基因核苷酸组成分析，结果显示4 种碱基含量不均一，而且A+T 的比例均高于G+C 的比例，与脊椎动物mtDNA 的特点一致［20］。mtDNA 2 个基因区段的碱基转换与碱基颠换比(R)依次为3.94 和3.27，这一结果符合脊椎动物线粒体基因组进化时碱基转换高于碱基颠换的规律;有研究认为当R值小于2 时基因的序列突变达到饱和，在构建系统树的过程中受进化噪音的影响易出现错误信息［21］，本研究中的R值均大于2，可进行构建系统树。从遗传多样性上来看，6 个种群在Cytb-D-loop区段的多样性水平均较高，而在COI区域变异较大，有的种群甚至没有出现遗传变异。有报道认为，由于不编码蛋白质，D-loop区域受进化选择的影响小，进化速度快，在不同物种或同一物种的不同群体表现出较高的遗传多样性［22］，这与我们的研究结果是一致的。

3.2 群体遗传分化及亲缘关系

从分组的分子生物学方差分析结果可以看出，将6 个种群分为同一个组，结果显示组内差异明显，说明6 个种群可能具有不同的种属来源;按照雅罗鱼属(SHJ、DL、GT 和BJ)和三块鱼属(TT、ZX)分组，结果显示组间差异显著，说明这6 个种群可能来源于不同的属;按照瓦氏雅罗鱼(SHJ、DL)、高体雅罗鱼(GT)、贝加尔雅罗鱼(BJ)、滩头雅罗鱼(TT)和珠星雅罗鱼(ZX)5 个种划分，结果显示组间差异不显著，说明这5 个种亲缘关系较近。

具体来看，DL 和SHJ 2 个地理群体的遗传距离最近，在COI和Cytb-D-loop区段上的遗传距离依次为0.002 和0.005，在系统进化树上始终聚在一起，此外，在本研究分析的2 个mtDNA 区段内没有发现能够区分这2 个地理群体的特异位点，但是作为同一个种，却发现很多共有且有别于其他4 个种群的种内特异位点，说明DL 和SHJ 2 个群体并没有因为栖息环境的巨大差异而出现明显的群体分化，应归属为瓦氏雅罗鱼种的2 个地理群体。池炳杰等［10］和Chang 等［11］利用SSR 标记检测发现，达里湖水系和黑龙江水系的瓦氏雅罗鱼种群由于有限的基因交流和对当地环境的适应性，2 个水系的群体出现了明显的遗传分化。但是否将这2 个水系的群体划分为2 个亚种，论据尚不充分。

贝加尔雅罗鱼和高体雅罗鱼在COI和Cytb-Dloop基因区段上遗传距离分别为0.072 和0.052，种群遗传分化检验发现，BJ 和GT 种群在COI和Cytb-D-loop出现了明显的遗传分化，而且在2 个基因区段分别发现了多个种内特异位点，应划分为2 个不同的种，这与胡文阁等［23］的研究结果是一致的，但是系统进化树支持将这两个种群聚为一支，说明这2 个种群亲缘关系较近。本研究中基于mtDNA 的聚类分析显示，瓦氏雅罗鱼(SHJ、DL)、高体雅罗鱼(GT)、贝加尔雅罗鱼(BJ)聚为一个大的分支，陈星玉［24］的研究发现，贝加尔雅罗鱼在骨骼结构上与瓦氏雅罗鱼接近。因此推断瓦氏雅罗鱼、高体雅罗鱼和贝加尔雅罗鱼具有属内水平的种间亲缘关系。

COI相对于Cytb和D-loop最为保守，进化速度最慢，更适合远缘物种进化研究［25］。本究中滩头雅罗鱼和珠星雅罗鱼在COI区域与另外4 个种群的遗传距离为0.137 ～0.147 和0.154 ～0.161。张凤英等［26］在比较2 种鲷属鱼类线粒体COI基因时发现，属间遗传距离介于0.138 ～0.182;Costa 等［27］在对澳大利亚122 个鱼属的COI条形码研究中发现，属间最大的遗传距离不超过0.206。根据遗传距离和系统聚类分析结果以及分子生物学方差分析检验结果来看，TT 和ZX 种群与其他种群为属间亲缘关系，这与生物学分类的结果是一致的，即滩头雅罗鱼和珠星雅罗鱼应划分为雅罗鱼亚科的三块鱼属。

根据黄小彧等［28］基于COI界定的种间划分依据(0.05 ～0.30)来看，TT 和ZX 种群在COI的遗传距离仅为0.045，不支持种间关系。但是二者在COI区域存在明显的遗传分歧，且在2 个mtDNA 区段均能找到多个种内特异位点，而同为种内关系的DL和SHJ 群体在2 个基因区段遗传分歧不明显，也没有群体特异位点，说明滩头雅罗鱼和珠星雅罗鱼的遗传结构存在显著差异;此外，陈金平［12］在探究绥芬河三块鱼属的分类中发现，滩头雅罗鱼和珠星雅罗鱼在磷片组成和骨骼结构上也存在明显差异;此外，本研究采集的这2 个种群地理隔离比较远，栖息环境差异大(海水、酸湖)。因此，结合前人和我们的研究结果，将滩头雅罗鱼和珠星雅罗鱼划分为三块鱼属的2 个不同的种比较合理。

总之，基于遗传距离、系统进化树及种内特异位点的研究结果，我们认为SHJ 和DL 2 个地理群体亲缘关系近，同属于瓦氏雅罗鱼;高体雅罗鱼和贝加尔雅罗鱼亲缘关系近，且与瓦氏雅罗鱼存在属内亲缘关系，同属于雅罗鱼亚科的雅罗鱼属;滩头雅罗鱼和珠星雅罗鱼亲缘关系近，且与雅罗鱼属的4 个种群存在属间亲缘关系，同属于雅罗鱼亚科的三块鱼属。

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