反相液相色谱-串联质谱法鉴定油菜蜂花粉中的蛋白质及活性肽

郭 静， 晏嘉泽， 郭 明， 靳 艳＊

（1.大连大学环境与化学工程学院，辽宁 大连116622；2.中国科学院大连化学物理研究所，中国科学院分离分析化学重点实验室，辽宁 大连116023）

蜂花粉含有蛋白质、糖类、脂类、维生素、微量元素等化学成分，被誉为“微型营养库”和“完全营养品”。蜂花粉作为药食同源物质在我国具有悠久的食用历史，近年来研究发现蜂花粉具有清除自由基、提高免疫力、抑制前列腺疾病、改善心血管疾病、抗肿瘤等功能［1］。邓建军等［2］分离提取了油菜蜂花粉中的不同蛋白质，并研究了其抗氧化活性。张红城等［3］对6种蜂花粉中不同酶的活性进行了研究。

以动植物蛋白质为原料，用酶解法制备具有生物活性的肽是生物活性肽的研究方向之一。蜂花粉中蛋白质含量丰富，可达7%～30%，为制备生物活性肽提供了丰富的资源。已有研究发现由蜂花粉制备的生物活性肽具有抗氧化［4］、抗辐射［5］、抗肿瘤［6］等活性。在生物活性肽的研究中，以抑制血管紧张素转化酶（ACE）为靶标的降血压肽尤为引人关注，最早的ACE抑制肽是从蛇毒中发现的［7］。酶法降解食物源蛋白质制备ACE 抑制肽具有安全性高等特点，现已从大豆蛋白质、藻蛋白质、鱼蛋白质等蛋白质酶解产物中分离得到大量的ACE 抑制肽［8-10］。

目前常用的生物活性肽研究方法是通过色谱分离等手段得到单一肽段，再利用质谱分析等技术鉴定肽段氨基酸序列，从而获得混合肽段中活性肽段的信息。但是传统的分离方法需要经过繁琐的分离纯化步骤才可以得到极少的目标产物，耗时耗力、效率低下。高通量、低损耗是质谱技术的发展趋势，相关行业研究领域也对此需求迫切［11］。基于液相色谱-质谱技术的鸟枪法是蛋白质组学研究的策略之一，该方法通过直接对蛋白质混合物进行酶解，经液相色谱-质谱分离，鉴定肽段，继而推导出样品蛋白质［12］。于海洋等［13］基于质谱学技术对锦灯笼中的蛋白质进行了鉴定及功能归属，Liu［14］等利用鸟枪法的策略分析了鹿血浆中的蛋白质，并结合ACE抑制肽的构效关系分析得到几条活性较好的ACE 抑制肽。本文以油菜蜂花粉为对象，利用鸟枪法蛋白质组学研究策略直接分析其蛋白质酶解产物，研究蛋白质组成，并在此基础上筛选具有ACE抑制活性的肽段，极大地缩短了活性肽的研究周期。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

RPLC-MS／MS系统由Finnigan Surveyor液相色谱泵、线性离子阱（LTQ）质谱组成（美国Thermo公司）；紫外／可见分光光度计（日本JASCO 公司）；机械式搅拌器（德国IKA 公司）；Magic C18AQ 反相色谱填料（5μm，12 nm，美国Michrom BioResources公司）；石英毛细管（75μm×120 mm，美国Polymicro Technologies公司）；Milli-Q 超纯水一体机（美国Millipore公司）。

胰蛋白酶、血管紧张素转化酶（EC3.4.14.1）、马尿酰组氨酰亮氨酸（HHL）、三氟乙酸（TFA）、牛血清白蛋白（BSA）、聚乙二醇辛基苯基醚（Triton X-100）、蛋白酶抑制剂（cocktail）均购自美国Sigma-Aldrich公司。二硫苏糖醇（DTT）、碘代乙酰胺（IAA）购自美国Bio-Rad公司。乙腈（ACN，HPLC 级）购自德国Merck 公司。乙二胺四乙酸（EDTA）、乙 二 醇 双（2-氨 基 乙 基 醚）四 乙 酸（EGTA）、苯甲基磺酰氟（PMSF）购自美国Amresco公司。油菜蜂花粉由宽甸万钧蜂业有限公司提供。其他药品和试剂均为国产分析纯或色谱纯。

1.2 蛋白质含量的测定

委托中国科学院沈阳生态所农产品安全与环境质量检测中心根据国家标准GB／T5009.5-2003 进行测定。

1.3 样品前处理

1.3.1 蛋白质的提取

向10 mL 50 mmol／L Tris-HCl缓 冲 液（pH 7.4，含8 mol／L 尿 素、1 mmol／L EDTA 和1 mmol／L EGTA）中加入0.1 g DTT，使其终浓度为65 mmol／L；再加入100μL Triton X-100，冰浴5～10 min 后，加 入100 μL cocktail 和100 μL 100 mmol／L的PMSF。将1.5 g经液氮环境中研磨破壁的油菜蜂花粉分散其中，超声提取3次（每次程序为：400 W 超声4 s，停4 s，80 个循环）。于4 ℃25 000 g离心力下离心1 h，吸取上清液，加入4倍体积的沉淀液（丙酮∶乙醇∶乙酸＝50∶50∶0.1，v／v／v），沉 淀 过 夜；于4 ℃25 000 g 离 心 力 下 离 心30 min，弃去上清液；丙酮洗涤脱色，于4 ℃25 000 g离心力下离心15 min，弃去上清液；丙酮反复洗涤直至上清无色，再用75%（v／v）乙醇洗去丙酮。于4℃25 000 g离心力下离心10 min，弃去上清液，沉淀物冷冻干燥后于-20 ℃保存。

1.3.2 蛋白质的酶解

冻干蛋白质用100 mmol／L NH4HCO3缓冲液（pH7.4，含8 mol／L尿素）复溶，Bradford法测定蛋白质浓度。取质量浓度为2 mg／mL 的蛋白质溶液1 mL，加入DTT 使其终浓度为20 mmol／L，于60℃水浴1 h；加入IAA 使其终浓度为40 mmol／L，室温避光放置40 min；加入100 mmol／L NH4HCO3，使尿素终浓度为1 mol／L，以酶∶蛋白质＝1∶25（w／w）的比例加入胰蛋白酶，于37 ℃酶解20 h。

1.3.3 蛋白质酶解产物的净化

C18SPE柱经3倍柱体积的乙腈活化，再用3倍柱体积的0.1%（v／v）三氟乙酸溶液洗去乙腈。蛋白质酶解产物用50%（v／v）三氟乙酸溶液调节pH值至2～3后过柱。经3倍柱体积的0.1%（v／v）三氟乙酸溶 液 脱 盐 后，用1.2 mL 80%（v／v）乙 腈／0.1%（v／v）三氟乙酸溶液分3次洗脱，洗脱液冷冻干燥后于-20 ℃保存。

1.4 RPLC-MS／MS分析

将冻干的酶解样品用0.1%（v／v）甲酸溶液复溶至0.4μg／μL，取20μL 进行RPLC-MS／MS 分析，重复3次。

将毛细管（内径75μm）的一端拉成内径约为5 μm 的尖端，把Magic C18AQ 填料压入柱内，填充柱长度在12 cm 左右，将毛细管柱与质谱相连。所用的流动相A 为0.1%（v／v）的甲酸溶液，流动相B为0.1%（v／v）的甲酸／乙腈溶液，流速为200 nL／min。梯度洗脱过程如下：0～2 min，0%B～5%B；2～122 min，5%B～35%B；122～125 min，35%B～80%B；125～135 min，80%B；135～137 min，80%B～0%B；137～150 min，0%B。

设置离子传输毛细管的温度为200 ℃，电喷雾电压为1.8 kV，归一化碰撞能量为35.0%。均使用数据依赖模式对MS和MS／MS进行图谱采集，扫描模式为全扫描。全扫描中丰度最高的6个离子峰进行MS／MS扫描，其中动态排除设置为：重复次数为2，重复容忍时间为30 s，动态排除时间为90 s。利用Xcalibur软件（Thermo）进行系统控制和数据收集。

1.5 数据库检索

采集的数据用SEQUEST 软件分别在蜜蜂（Apis，蛋 白 质 数 目 为14 295）和 油 菜（Brassica campestris L.，蛋白质数目为41 262）蛋白质数据库（http：／／www.uniprot.org／）中进行检索。检索参数为：酶为胰蛋白酶，最高允许漏切位点为2，前体离子的质量容忍度为2 Da，碎片离子的质量容忍度为1 Da。搜库结果通过本实验室创建的Armone软件［15］进行优化，筛选标准为Xcorr（cross correlation value）不小于1.9、2.2 和3.75（分别对应＋1，＋2和＋3价离子），肽段假阳性率（FDR）控制在1%以内。

1.6 肽段合成及其ACE抑制活性的检测

委托杭州中肽公司（浙江杭州）合成肽段，经RPLC-MS检测纯度。将Cushman 等［16］的方法改进后 进 行 体 外ACE 抑 制 活 性 测 定：将50 μL 5 mmol／L HHL与50μL50 mmol／L的硼酸盐缓冲液（pH8.3，含300 mmol／L NaCl）混合均匀，加入50 μL一定浓度的抑制剂溶液，于37 ℃水浴5 min；加入50μL0.1 U／mL的ACE，于37℃水浴30 min，加入200μL 1 mol／L 的HCl终止反应；再加入1 mL乙酸乙酯振荡15 s，于3 500 r／min离心5 min；取0.8 mL上清液，于90 ℃水浴干燥15 min，复溶于0.8 mL水中，于228 nm 处检测吸光值。

抑制率计算公式为：

其中R 表示抑制率；A 表示对照组（将抑制剂溶液用缓冲液替代）的吸光度值；A0表示空白对照组（将抑制剂溶液和ACE 均用缓冲液替代）的吸光度值；B 表示样品组的吸光度值；B0表示空白样品组（将样品组的ACE用缓冲液替代）的吸光度值。

2 结果与讨论

2.1 油菜蜂花粉蛋白质分析

油菜蜂花粉样品经测定，其蛋白质含量为29.1%。油菜蜂花粉按照1.3节中方法处理后进行RPLC-MS／MS分析，基峰色谱图如图1 所示。经检索，在蜜蜂（Apis）蛋白质库中共鉴定到62 条肽段，在油菜（Brassica campestris L.）蛋白质库中共鉴定到291条肽段，油菜蜂花粉中的大部分蛋白质来源于油菜。不同物种中鉴定到的相同序列不进行重复计数，鉴定到肽段的来源分布见图2。这353条肽段所归属的蛋白质，有239个蛋白质在Universal Protein数据库中可以查找到其分子生物学功能，主要有结 合 活 性（binding activity）、酶 活 性（enzyme activity）、运输活性（transporter activity）、结构组成（structural constituent）、催 化 活 性 （catalytic activity）、抑制活性（inhibitor activity）等。在所鉴定到的蛋白质中，有些同时具有多重分子生物学功能，如UvrABC system protein B同时具有催化活性和结合活性。

图1 RPLC-MS／MS分析油菜蜂花粉蛋白质酶解产物的基峰色谱图Fig.1 Base peak chromatogram of protein degradation from rape bee pollen by RPLC-MS／MS analysis

图2 鉴定肽段的来源分布Fig.2 Source distribution of the identified peptides

这些蛋白质按生物学功能分类情况如图3 所示，图中数值代表具有该功能的蛋白质数量，其中61%的蛋白质具有结合活性或酶活性。结合活性包括：结合离子（如锌离子、钙离子、铁离子、镁离子等）的活性；结合脱氧核糖核酸（DNA）、核糖核酸（RNA）、三磷酸腺苷（ATP）等的活性；结合脂质、铁血红素、碳水化合物以及结合辅助因子的活性。酶活性包括氧化还原酶活性、水解酶活性、异构酶活性、合成酶活性等。

图3 油菜蜂花粉中鉴定到的蛋白质的生物学功能分类Fig.3 Biological function distribution of the proteins identified in rape bee pollen

2.2 ACE抑制肽的筛选

ACE抑制肽的生物活性受肽段氨基酸组成、序列结构和长度的影响。大多数ACE 抑制肽由2～12个氨基酸组成，C 末端氨基酸多为芳香族氨基酸（如Y、F）或疏水氨基酸（如L、I）［17，18］。Cushman等［19］认为肽段C 末端三肽强烈影响其ACE抑制活性，能够与ACE活性位点相互作用的最为理想的C末端三肽序列为FAP或者WAP，而W、Y、P、F则被认为是C 末端最合适的氨基酸残基；同时当N 末端为支链氨基酸如V、I时，肽段对ACE 活性抑制较强。Meisel等［20］通过计算机分子建模对ACE 抑制肽构效关系进行研究，发现抑制肽能与不被底物所占据的亚活性位点或不同于ACE 催化部位的阴离子抑制剂结合位点相互作用，ACE抑制肽中相似的正电势几乎均位于C 末端的相同区域。肽段中疏水性氨基酸的含量也会对其活性有较大的影响［21］。根据以上内容推测在本实验中鉴定到的353条肽段中，AGFAGDDAPR、AELDIVLALFK、LAVNLIPFPR、IIIALLLYK 和LLICGGSAYPR 这5 条 肽 段 可能具有ACE抑制活性。

C 末端以P、F结束的肽段对ACE 具有很强的抑 制活 性［22，23］。Ghassem 等［24］从 鱼 类 蛋 白 质 中 分离出以P结束的肽段NGTVVFEPP，该肽段具有较高的ACE抑制活性。Saiga等［25］从鸡胸肉中分离纯化出P4肽（GFHypGTHypGLHypGF），并对其氨基酸序列结构与ACE 抑制活性之间的关系进行了研究，发现当移除C 末端的F后，对ACE 的抑制活性大大降低，半数抑制浓度（IC50）由46μmol／L 升至25 000 μmol／L。鉴 于 以 上 报 道，将 筛 选 到 的AELDIVLALFK 和LAVNLIPFPR肽段C 端的K、R去掉，序列变为AELDIVLALF 和LAVNLIPFP，推测其会具有更高的ACE抑制活性。

2.3 ACE抑制活性测定

化学合成2.2节中推测具有ACE 活性的肽段并测定其ACE 抑制活性，结果见表1。其中AGFAGDDAPR来源于蜜蜂，其对ACE 活性抑制的IC50值为（202.48±9.60）μmol／L。该肽段C 末端三肽中有A、P两个疏水性氨基酸，N 末端为支链氨基酸A，符合ACE抑制肽的构象特征。其他4条肽段均来源于花粉，其中肽段AELDIVLALF对ACE活性的抑制效果最好，其IC50值为（10.65±0.50）μmol／L。在ACE 抑 制 肽 数 据 库（http：／／www.cftri.com／pepdb／index.php）中，已知抑制ACE 活性IC50值的肽段有619条，将AELDIVLALF的IC50值与之比较后排序，结果位于第147位，抑制活性居数据库中前24%。肽段AELDIVLALF的C 末端三肽均为疏水性氨基酸，分别是A、L 和F，C 末端为F，且整条肽段含有较多的疏水性氨基酸，包括A、V、L、F和I。LAVNLIPFP的抑制活性位于数据库中前34%，其IC50值为（23.66±1.08）μmol／L。其C 末端三肽含芳香族氨基酸F、疏水性氨基酸P，N末端为支链氨基酸L，且含有2／3的疏水性氨基酸，包括A、V、L、F、I和P，具有良好的ACE 抑制肽的结构。LLICGGSAYPR 和IIIALLLYK 也表现出较好的ACE 抑制活性，IC50值分别为（43.58±1.96）μmol／L和（28.61±1.37）μmol／L，这两条肽段C末端三肽均含有两个疏水性氨基酸，N 末端均为支链氨基酸，且疏水性氨基酸在整条肽链中比例均在50%以上。本方法基于蛋白质组学分析，结合构效关系筛选生物活性肽，通过化学合成肽段后进行生物活性验证，相比需要经繁复的分离过程才能得到极少产物的常规生物活性肽鉴定、纯化方法，大大缩短了鉴定周期。

表1 源于油菜蜂花粉的ACE抑制肽Table 1 ACE inhibitory peptides from rape bee pollen

表2是上述ACE 抑制肽所属蛋白质的分子生物学功能描述，5条肽段所属的蛋白质具有结合功能、酶催化活性以及结构组成等功能。细胞膜上Na＋-K＋-ATP酶和Ca2＋-ATP酶活性降低引起的细胞内Ca2＋浓度升高是高血压发病的关键机制［26］，三磷酸鸟苷（GTP）在GTP酶的催化作用下先转化为二磷酸鸟苷（GDP），之后转化成ATP。GTP酶活性及GTP 结合功能将直接或间接影响Na＋-K＋-ATP酶和Ca2＋-ATP酶的活性，从而影响高血压发病。ABC（ATP-binding cassette transporter）家族是一组ATP结合转运蛋白质，主要从事细胞内外的物质转运，早期认为该家族主要与肿瘤细胞的多药耐药性有关，近年来发现其在各个器官及疾病（尤其是心血管疾病）中表现出多种其他重要病理和生理功能［27］。从筛选出的肽段所属蛋白质的生物功能上分析，这些肽段均与高血压存在一定的相关性。

表2 ACE抑制肽所属蛋白质的分子生物学功能Table 2 Molecular biological functions of the proteins that ACE inhibitory peptides belong to

3 结论

本文基于鸟枪法蛋白质组学策略，利用蛋白质组学分析平台对油菜蜂花粉蛋白质进行研究，共鉴定到353条肽段，其所属蛋白质具有结合活性、酶活性及运输活性等分子生物学功能。根据ACE 抑制肽的构效关系进行筛选及修饰，得到AGFAGDDAPR、AELDIVLALF、LAVNLIPFP、IIIALLLYK 和LLICGGSAYPR这5条可能具有ACE 抑制活性的肽段。化学合上述成肽段并进行ACE 抑制活性验证，结果显示这5条肽段均具有良好的活性，其中肽段AELDIVLALF和LAVNLIPFP 表现出较高的抑制活 性，IC50值 分 别 为（10.65±0.50）μmol／L 和（23.66±1.08）μmol／L。以上结果表明，将蛋白质组学分析平台与活性肽构效相结合可用于快速、高效筛选ACE抑制肽。

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