菜籽分离蛋白分子质量分布及酶解条件的研究

高瑀珑 郑 锐 王玉梅 王立峰 鞠兴荣 袁 建

(南京财经大学食品科学与工程学院 江苏省粮油品质控制及深加工技术重点实验室，南京 210023)

菜籽分离蛋白分子质量分布及酶解条件的研究

高瑀珑 郑 锐 王玉梅 王立峰 鞠兴荣 袁 建

(南京财经大学食品科学与工程学院 江苏省粮油品质控制及深加工技术重点实验室，南京 210023)

以脱脂“双低”油菜籽为原料，利用碱溶解酸沉淀法提取菜籽分离蛋白；用SDS-PAGE凝胶电泳研究菜籽蛋白的分子质量的组成；以水解度和氮回收率为考察指标，用响应面分析法拟合了Alcalase 2.4L酶解菜籽蛋白成菜籽肽的二次多项数学模型，优化了酶解菜籽分离蛋白的工艺参数。SDS-PAGE凝胶电泳研究表明利用碱溶解酸沉淀提取的菜籽分离蛋白主要是2S清蛋白。响应面分析法研究的试验结果表明，酶的使用量、pH、酶解温度、酶的使用量与pH的交互作用对Alcalase 2.4L酶解菜籽蛋白的水解度和氮回收率的影响均显著(P<0.05)。通过求解菜籽肽的二次多项数学模型的逆矩阵方程，可得Alcalase 2.4L水解菜籽分离蛋白的最佳条件为：酶的使用量0.05 Au/g，pH 9.0，酶解温度54 ℃；在此酶解条件下，菜籽分离蛋白浓度为5%时，水解5 h，所得的水解度和氮回收率分别为35.12%及52.96%。

菜籽分离蛋白 SDS-PAGE电泳 酶解 水解度 氮回收率 响应面法

过去人们一直认为机体对蛋白质的吸收是以单个氨基酸的方式进行的。目前研究表明许多小分子的肽也能够直接被机体吸收和利用，并发挥重要的生理功能。国内外研究发现，植物蛋白多肽在治疗人类疾病方面具有多种生物功能，如抑菌性，免疫调节活性，抗氧化、抗血栓、降血脂、降低胆固醇含量等生理活性[1-3]。近年来研究发现，以菜籽蛋白为原料通过酶解得到的菜籽肽，其加工特性如溶解性、乳化性、持水性等明显优于菜籽蛋白[4-5]；同时也发现其中的一些小分子的菜籽肽不仅吸收快、耗能低、吸收率高，还具有抗氧化、降血压、抗肿瘤和促进动物细胞生长等生物活性[6]。

国内外学者利用不同的水解酶对菜籽蛋白酶解来制备菜籽肽，并对其加工特性及生物活性进行了研究，结果证实了Alcalase酶的酶解产物具有较好的加工功能及生物活性。黄亮等[7]以菜籽蛋白为原料，水解度为衡量指标，对酸性蛋白酶、碱性蛋白酶和中性蛋白酶的酶解作用进行对比分析，最终确定Alcalase酶的酶解效果较好，使菜籽分离蛋白水解度可达32.19%。He等[8]研究了Alcalase 2.4L蛋白酶、K蛋白酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶、风味酶和嗜热菌蛋白酶酶解菜籽蛋白的产物菜籽肽的抗氧化活性，发现Alcalase 2.4L和K蛋白酶的酶解产物菜籽肽的抗氧化性效果较好。Makinen等[9]利用胃蛋白酶、胰蛋白酶、碱性蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶和嗜热菌蛋白酶对菜籽粕进行酶解，结果表明Alcalase 2.4L水解物具有最高的血管紧张素转换酶抑制活性及抑制脂肪氧化活性。

菜籽蛋白组分较复杂，本研究以脱脂“双低”油菜籽为原料，用碱溶解结合酸沉淀的方法来获得混合菜籽分离蛋白，利用SDS-PAGE凝胶电泳法对混合菜籽分离蛋白的分子质量的分布进行了分析，然后再对此混合菜籽分离蛋白的Alcalase 2.4L酶解工艺进行了优化。国内外很少有文献用碱溶解结合酸沉淀的方法对混合菜籽分离蛋白的分子质量分布进行系统、深入的研究，一些文献仅报道了从菜籽粕中提取并分离出几种蛋白[10-12]，同时，许多研究也仅以单一指标(水解度或肽得率)为响应值来优化菜籽肽的制备条件，不能全面的反映菜籽蛋白的酶解效果[10,13]。本研究以Alcalase 2.4L酶的使用量、pH值及酶解温度作为影响因素，Alcalase 2.4L水解物的水解度和氮回收率2个指标为响应值，采用响应面分析方法优化菜籽肽的制备，为进一步开发和利用菜籽肽提供了条件和理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

甘蓝型“双低”油菜籽宁杂21号：江苏省农业科学院；宽范围彩色预染蛋白质Marker(11 ku-245 ku)：北京天根生化科技有限公司；Alcalase 2.4L：诺维信公司；N,N-甲叉双丙烯胺(Bis)：美国Bio-RAD公司；Tris、过硫酸铵、SDS、TEMED：sigma公司；丙烯酰胺(Acr)、甘氨酸(Gly)、考马斯亮蓝R-250、溴酚蓝和β-巯基乙醇：美国Amresco公司；石油醚、无水乙醇、硫酸铜、硫酸钾、氢氧化钠、硼酸、浓硫酸和浓盐酸等均为分析纯。

1.2 主要仪器与设备

JFSD-70实验室粉碎磨：上海市嘉定粮油检测仪器厂；SXT-8索氏抽提装置：南京晚晴化玻仪器有限公司；J6HC冷冻离心机：美国Beckman Coulter公司； Milli-Q纯水机：美国Merck Millipore公司；KjelFlex K-360 凯氏定氮仪：瑞士Buchi公司；GM-0.33A隔膜真空泵、FD-JH-JS-1000 mL玻璃砂芯过滤装置：天津津腾实验设备有限公司；FreeZone 6L真空冷冻干燥机：美国LABCONCO公司；Mini-Protean Tetra C微型垂直电泳仪：美国Bio-RAD公司；HH-4 数显恒温水浴锅、85-2 恒温磁力搅拌器：国华电器有限公司；TDL-5-A 低速大容量多管离心机：上海安亭科学仪器厂；PHS-3C雷磁pH计：上海精密科学仪器有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 原料预处理

“双低”油菜籽去皮后，利用石油醚脱脂。将1 kg去皮油菜籽置于索氏抽提器中，处理72 h，待油脂抽提干净后，置于通风橱干燥，粉碎，过100目筛，得脱脂菜籽粉备用。

1.3.2 菜籽蛋白测定

采用半微量凯氏定氮法[14]。

1.3.3 菜籽分离蛋白制取工艺

由于菜籽中存在硫甙、多酚和植酸等抗营养因子，其应用受到了限制[15]。菜籽蛋白的制备参见文献[4,16]的方法，并做适当的修改，以去除部分植酸及多酚类物质。

具体方法：取适量菜籽粉→搅拌、浸提2 h (料液质量体积比1∶20，25 ℃，pH 5，浸提2次，去植酸)→离心 (4 000 r/min,10 min)→收集沉淀→碱溶解 (料液比1∶20，25 ℃，pH 11，搅拌1 h)→ 离心 (4 000 r/min，10 min)→ 收集上清液→ 酸沉淀 (pH 4.5，30 min)→ 离心 (4 000 r/min,10 min)→ 收集沉淀→ 用95%乙醇清洗 (3次，去除单宁)→ 收集沉淀→ 冷冻干燥，研磨，过100目筛→菜籽蛋白。

1.3.4 蛋白质分子质量分布的测定

1.3.4.1 SDS-PAGE凝胶电泳所用试剂的配制

SDS-PAGE凝胶电泳凝胶的配制见表1。

表1 凝胶的配制

其他试剂：

1)2×样品缓冲液(10 mL)：40%甘油2 mL，溴酚蓝0.020 2 g，Tris-HCl (pH 6.8，1.0 mol/L)1 mL，β-巯基乙醇0.14 mL，10%SDS 4 mL，H2O 3 mL；

2)5×Tris-Gly Buffer (电极缓冲液，1 L)：0.125 mol/L Tris，1.25 mol/L Glycine，0.5% SDS (Tris 15.1 g，Glycine 94 g，SDS 5 g，蒸馏水1 000 mL)；

3)考马斯亮蓝R-250染色液(200 mL)：0.2 g R-250，84 mL 95%乙醇，20 mL冰醋酸，加水定容至200 mL，滤纸过滤；

4)脱色液(1 L)：100 mL 甲醇，100 mL 冰醋酸，800 mL蒸馏水。

1.3.4.2 SDS-PAGE凝胶电泳

采用电泳仪进行SDS-PAGE凝胶电泳，按照文献[17]的方法，并作适当的修改。具体方法：将菜籽蛋白溶液(5 mg/mL)与样品缓冲液按1∶1的体积比混合，100 ℃煮沸5～7 min，上样10 μL，电压为100 V，时间为2～3 h，考马斯亮蓝R-250染色，染色时间30 min以内，置于脱色液中脱色，过夜，待胶片背景蓝色呈透明状，拍照，观察并分析菜籽蛋白的分子质量分布。

1.3.5 菜籽蛋白的酶解

按照文献[4]的方法，并作适当修改。具体方法：将5%菜籽蛋白溶液置于50 ℃的水浴中，调整pH，加入适当的Alcalase 2.4L酶解液，添加适量的NaOH使体系pH不变，5 h后，置于95 ℃水浴中处理10 min进行灭酶，冷却(pH调至4.5)，30 min后，离心(10 000 r/min，10 min，沉淀未酶解的大分子蛋白及不溶物)，收集上清液，调pH至7.0，经0.45 μm微滤膜微滤，冷冻干燥后得菜籽粗肽。

1.3.6 水解度(Degree of hydrolysis,DH)的测定

采用pH-stat法[18]测菜籽蛋白水解度。DH为菜籽蛋白被水解的肽键的比例，DH计算按照式(1)。

(1)

式中：V为消耗NaOH的体积/mL；C为标准NaOH 的浓度/mol/L；mp为蛋白质的质量/g；htot为每克蛋白质底物具有的肽键毫摩尔数，其取值为7.8 mmol/g；α为样品分离蛋白氨基平均解离度，其取值为0.55。

1.3.7 氮回收率(Nitrogen recovery,NR)的测定

氮回收率的测定按照文献[4]，并作适当修改。具体方法：将酶解液置于95 ℃水浴中灭酶10 min，酶解液冷却后pH调至4.5，30 min后，离心(10 000 r/min，10 min，沉淀未酶解的大分子蛋白及不溶物)，收集上清液，采用凯氏定氮仪测定上清液中蛋白含量。NR计算按照式(2)。

(2)

式中：M0为上清液蛋白质含量/g；M1为酶解液开始反应中蛋白质含量/g。

1.3.8 单因素试验

根据前期预研究试验的结果，发现影响菜籽分离蛋白酶解的主要因素有酶的使用量、pH值、酶解温度，本研究考察了这3个主要因素对DH及NR的影响，酶的使用量采用0.012、0.024、0.036、0.048、0.06 Au/g 5个水平；pH值采用7.5、8.0、8.5、9.0、9.5 5个水平；酶解温度采用40、45、50、55、60 ℃ 5个水平。

1.3.9 酶解工艺响应面分析法优化试验

在单因素试验的基础上，采用三因素三水平的响应面分析法(RSM)进行菜籽蛋白的Alcalase 2.4L酶解优化试验，获得酶解过程中影响DH及NR的最佳工艺参数。

1.3.10 数据分析

应用Design-Expert 8.0.4软件对试验进行设计和数据分析。

2 结果与分析

2.1 菜籽蛋白分子质量分布

菜籽粕中的蛋白质主要包括12S球蛋白和2S清蛋白，同时还含有一些较小的蛋白质，如胰岛素抑制剂、硫堇和转脂蛋白[19]。12S的球蛋白平均分子质量约为300 ku，在极端pH和尿素溶液中可完全离解成6个亚基，每个亚基有2条约30和20 ku的多肽链组成，多肽链间由二硫键连接；2S的清蛋白分子质量在12.5和14.5 ku之间，其中有2个多肽链靠2个二硫键连接；小的多肽链分子质量为4.5 ku，大的为10 ku[20]。SDS-PAGE具有分辨率高、重复性好、设备简单、操作容易的特点，但SDS-PAGE不能求得每个蛋白质的分子质量，其测定的是蛋白质亚基或单肽链蛋白质的分子质量[21]。

利用SDS-PAGE凝胶电泳分析菜籽分离蛋白的分子质量组成见图1。从图1中看出共有11个条带，3～8为12S球蛋白的多肽链条带，10、11为2S清蛋白的多肽链条带，1,2可能为12S球蛋白的亚基条带，颜色较浅，发生了降解，9可能为未变性2S清蛋白条带。SDS-PAGE凝胶电泳分析说明利用碱溶解酸沉淀所提取的菜籽分离蛋白的主要成分为2S清蛋白，2S清蛋白的含量大于12S菜籽谷蛋白。

注：1表示蛋白质marker;2、3、4表示菜籽分离蛋白。图1 菜籽分离蛋白凝胶电泳图

2.2 单因素试验

2.2.1 酶的使用量对菜籽蛋白的水解度(DH)及氮回收率(NR)的影响

为了探明Alcalase 2.4L的使用量对菜籽蛋白的DH及NR的影响，所以固定酶促反应的其他条件为：pH 8.0，酶解温度50 ℃，底物浓度5%，酶解时间5 h。以DH及NR为测定指标，结果见图2。从图2可以看出，在水解反应中，随着Alcalase 2.4L酶使用量的增加，DH及NR会不断增加。因随着酶的使用量增加，其与底物结合的几率增大，从而增加了菜籽蛋白的水解程度。当酶量增加到饱和以后，水解度及氮回收率增加趋于平缓。在实际操作过程中，酶的使用量增加会提高生产成本，也不利于酶解过程的控制，因此从经济节约的角度考虑，本研究选择酶解反应中酶的使用量为0.036～0.06 Au/g的范围。

图2 酶的使用量对水解度及氮回收率的影响

2.2.2 pH对菜籽蛋白的水解度及氮回收率的影响

为了明确单因素pH对DH及NR的影响，固定酶解反应的其他条件为：酶的使用量0.048 Au/g，pH 8.0，酶解温度50 ℃，底物浓度5%，酶解时间5 h，以DH及NR为测定指标，结果见图3。如图3所示，随着pH的增加，DH及NR均呈先升高后降低的趋势，两者在pH 9.0左右均达到最高值。一般情况下，一种酶仅在一个狭窄的pH值范围内具有最高活力，即酶的最适pH值。pH值能够改变底物的解离状态，影响底物与酶的结合。过酸或过碱会改变酶的空间构象，引起酶与底物结合受阻，进而导致酶失活。本研究酶解反应中pH的取值范围选择8.5～9.5。

图3 pH对水解度及氮回收率的影响

2.2.3 酶解温度对菜籽蛋白的水解度及氮回收率的影响

为了确定酶解温度对DH及NR的影响，所以固定酶促反应的其它条件为，酶的使用量 0.048 Au/g，pH 9.0，底物浓度5%，酶解时间5 h，以DH和NR为测定指标，结果见图4。随着酶解温度的升高，DH及NR值先升高后降低，两者在50 ℃左右均达到最大。酶促反应有最适温度，一般随着温度的升高反应物分子间接触的频率增加，酶促反应加快；当温度上升到一定程度，酶分子吸收能量过多，引起维持酶分子结构的次级键解体，导致酶蛋白变性，从而使酶活性减弱或丧失。从图4中可以看出Alcalase 2.4L作用的温度范围较宽，在45～55 ℃都具有较强的活性。

图4 酶解温度对水解度及氮回收率的影响

2.3 响应面分析法优化酶解条件结果分析

2.3.1 响应面分析法因素、水平的选取及试验结果

根据Box-Behnken设计原理[22]，在单因素试验的基础上，以酶的使用量(A)、pH值(B)、酶解温度(C)3个关键因素为自变量，试验的因素、水平及其编码的选取值见表2；DH及NR2指标为响应值(Y)，利用Design-Expert软件，本研究的三因素三水平共17个试验组的试验设计及其结果见表2。

2.3.2 回归方程的拟合及方差分析

通过Design-Expert软件对响应值与各因素的编码值进行回归拟合，得到DH及NR对3个因素的回归拟合方程分别为式(3)和式(4)：

Y(DH)=33.43+2.59×A+1.67×B+2.46×C+1.60×A×B-0.16×A×C+0.13×B×C-2.61×A2-2.48×B2-1.89×C2

(3)

Y(NR)= 51.89+0.48×A-0.96×B+1.01×C+0.47×A×B+0.20×A×C-0.090×B×C-0.90×A2-1.96×B2-0.38×C2

(4)

表3为模型、各个因素及其交互作用的回归方差分析，由表3可知，试验所选用的二次多项模型极显著(P(DH)=0.000 2，P(NR)<0.000 1)，P值越小，其越显著；失拟项在P= 0.05水平上不显著(P(DH)=0.114 2 >0.05，P(NR)=0.666 2>0.05)，说明模型的各个处理间差异显著，而模型的计算结果与检验结果间差异不显著，模型选择合理。DH及NR的校正决定系数(Radj2)分别为0.931 1和0.971 4，表明模型拟合程度好，试验误差小，可用模型来分析和预测Alcalase 2.4L酶解菜籽蛋白的水解度和氮回收率。DH仅约有6.9%，NR仅约有2.9%的总变异不能由各自拟合的模型来解释。

表2 响应面试验设计及其结果

注：A为酶的使用量；B为pH值；C为酶解温度；表中a表示平均值±标准误。

表3 回归方程的方差分析及其系数的显著性检验

注：DH为菜籽蛋白的水解度；NR为菜籽蛋白的氮回收率。

各影响因子酶的使用量(A)、pH(B)、酶解温度 (C)及其交互作用的方差分析表明：A、B、C、A2、B2对DH与NR影响极显著，说明酶解过程中，A、B、C对DH与NR均有显著影响；AB对DH与NR影响也比较显著。

2.3.3 Alcalase 2.4L的酶解制备菜籽肽的响应面分析

拟合模型的响应面图可比较直观地解释各变量和变量之间对响应值的影响。将建立的回归拟合模型中任一因素固定在零水平，得到另外两因素的交互影响，以DH及NR为响应值的二次回归方程的响应面，分别见图5、图6。

从图5和图6可以看出，酶的使用量、pH、酶解温度对酶解过程中的水解度和氮回收率影响都极显著。图5a中，随着酶的使用量和pH的增加，DH逐渐增加，但pH从9.1增加到9.5时，DH逐渐降低，可能是碱性过强导致酶失活；图5b中，随着酶的使用量和酶解温度的增加，DH增加趋势明显，说明酶的使用量和酶解温度对DH的增加具有促进作用；图5c中，酶解温度的增加利于水解的进行，而pH在上升到一定值后，pH的继续增加会导致DH值的降低。图6a中，酶使用量的增加有助于NR值的增加；在一定的pH范围内，NR值随pH的升高而升高，pH达到9.0后，随着pH的增加，NR值快速下降；图6b中，酶的使用量、酶解温度与NR值呈正相关，酶量和酶解温度的增加均有利于氮的回收；图6c中，pH和酶解温度对NR的影响趋势相对平缓，二者的交互作用对NR的影响不明显。

图5 Alcalase 2.4L酶解过程中影响菜籽蛋白水解度DH的响应面图

2.3.4 模型的优化与验证

利用 Design-Expert软件，在试验因素取值范围内，当响应值选取最大值时，通过求解Alcalase 2.4L酶解菜籽蛋白为菜籽肽的二次多项模型的逆矩阵，可得到酶解菜籽蛋白的最佳工艺参数为，酶的使用量0.053 Au/g，pH 9.03，酶解温度54.31 ℃；在此条件下，DH的预测值为34.89%，NR为52.52%。考虑到实际应用，将数据修正为酶的使用量0.05 Au/g，pH 9.0，酶解温度54 ℃；在此条件下，进行模型验证试验，得到的实际DH和NR值分别为35.12%及52.96%，与回归模型预测的理论值相差不显著，仅为0.23%和0.44%，表明基于响应面法得到的酶解制备菜籽肽的模型准确可靠。

图6 Alcalase 2.4L酶解过程中影响菜籽蛋白NR的响应面图

3 讨论

油菜籽榨油后的饼粕中含35%～47%的蛋白质，是一种优质的植物蛋白质，为全价蛋白质。但由于菜籽饼粕中含有硫甙、多酚和植酸等有毒物质或抗营养因子，这造成菜籽饼粕只能作为饲料或肥料使用，其价值远未被开发利用，造成植物性蛋白资源的极大浪费。本研究以脱脂“双低”油菜籽为原料，芥酸和硫甙含量符合安全标准，菜籽分离蛋白等电点范围分布在pH 4～7之间，植酸在pH 5左右时溶解性最大，多酚类物质溶解于乙醇，可通过浸提和醇洗进一步去除植酸及多酚类物质，因此，本研究利用碱溶解结合酸沉淀的方法可制取得到优质的菜籽分离蛋白。

菜籽蛋白组分复杂，主要含有12S球蛋白和2S清蛋白。国内外很少有文献对碱溶酸沉法提取的混合菜籽蛋白的分子质量分布进行系统、深入研究的报道。本研究利用SDS-PAGE凝胶电泳法对菜籽分离蛋白的组分进行了分析，表明我们所制取的菜籽分离蛋白的主要成分为2S清蛋白。而Chabanon等[4]利用碱溶酸沉法提取的菜籽分离蛋白主要组分为12S谷蛋白，这可能与菜籽蛋白的组成和油菜籽的品种有关。

仅以单一指标(水解度或肽得率)为响应值来优化菜籽肽的制备条件，不能全面反映菜籽蛋白的酶解效果。本研究综合考虑水解度和氮回收率2个指标，利用响应面法优化菜籽分离蛋白的酶解工艺条件，从而获取了水解度和氮回收率均较高的菜籽蛋白水解物，为了后期菜籽肽生物活性和加工特性的研究做了铺垫，利用酶法从菜籽蛋白中释放生物活性肽对于深度开发利用菜籽蛋白产品具有重要意义。生物活性肽由于具有特殊的生理功能，利用食源性蛋白质来制备活性肽是当前国际研究热点。菜籽分离蛋白经酶水解后表现出的多种生物活性，相关研究结果我们将继续进行报道。

4 结论

SDS-PAGE凝胶电泳分析表明利用碱溶解酸沉淀提取所得的的菜籽分离蛋白的主要成分为2S清蛋白，2S清蛋白的含量大于12S菜籽谷蛋白。

通过Design Expert软件采用Box-Behnken试验设计方法拟合了Alcalase 2.4L酶解菜籽分离蛋白的DH和NR的二次多项模型方程，该模型显著；模型系数的显著性检验表明，酶的使用量、pH、酶解温度、酶的使用量与pH的交互作用对Alcalase 2.4L酶解过程中菜籽蛋白DH和NR的影响均极显著。

通过响应面法优化了Alcalase 2.4L酶解菜籽分离蛋白的工艺参数，最佳条件为酶的使用量0.05 Au/g，pH 9.0，酶解温度54 ℃，在菜籽蛋白浓度为5%的条件下水解5 h，得到DH和NR的值分别为35.12%及52.96%，与回归模型预测的理论值相差0.23%和0.44%，说明应用响应面法优化Alcalase 2.4L酶解菜籽分离蛋白工艺条件具有实际应用价值。

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Molecular Weight Distribution of Rapeseed Protein Isolate and Optimization of Enzymatic Hydrolysis Process

Gao Yulong Zheng Rui Wang Yumei Wang Lifeng Ju Xingrong Yuan Jian
(Key Laboratory of Grain & Oils Quality Control and Deep-Utilizing Technology of Jiangsu Province, College of Food Science and Engineering, Nanjing University of Finance and Economics, Nanjing 210023)

Defatted meal of double-zero rapeseed has been adopted as material in the paper. The methods of alkaline extraction and acid precipitation were employed to extract rapeseed protein isolate; SDS-PAGE gel electrophoresis has been adopted to explore the molecular weight distribution. On the basis of single-factor experiments, response surface methodology (RSM) was utilized to built second-order polynomial equations and to optimize conditions of enzymatic hydrolysis process with Alcalase 2.4L; the selected response values were degree of hydrolysis (DH) and nitrogen recovery (NR). Analyses by electrophoresis showed that this protein isolate was mainly composed of more 2S albumins than 12S globulins. The experimental results showed that adding enzyme amount, pH, temperature and the interaction of enzyme amount and pH would have a significant effect onDHandNR(P<0.05). Maximum yield was obtained according to the inverse matrix equation of the second-order polynomial model when enzyme amount added; pH and temperature were 0.05 Au/g, pH 9.0, 54 ℃, respectively. The conditions resulted in 35.12% ofDH, 52.96% ofNRafter 5 h hydrolysis with a rapeseed protein isolate substrate of 5%.

rapeseed protein isolates, SDS-PAGE gel electrophoresis, enzymatic hydrolysis, degree of hydrolysis, nitrogen recovery, response surface methodology

TS253.1

A

1003-0174(2014)06-0038-08

国家农业科技成果转化资金(2011GB2C100012，2012GB24490611)，国家科技支撑计划(2012 BAD37 B08)，南京财经大学预研究项目(Y2012014)

2013-06-17

高瑀珑，男，1974年出生，博士，副教授，食品生物技术