饲粮添加胆碱对鹅免疫性能和肝脏组织学的影响

张文旭 王宝维 毛 珂 葛文华 张名爱 李文立

(青岛农业大学动物科技学院1，青岛 266109)(青岛农业大学优质水禽研究所2，青岛 266109)(青岛蔚蓝生物集团有限公司3，青岛 266061)

饲粮添加胆碱对鹅免疫性能和肝脏组织学的影响

张文旭1王宝维2毛 珂3葛文华2张名爱2李文立1

(青岛农业大学动物科技学院1，青岛 266109)(青岛农业大学优质水禽研究所2，青岛 266109)(青岛蔚蓝生物集团有限公司3，青岛 266061)

研究饲粮中添加不同水平胆碱对鹅免疫性能和肝脏组织学的影响。选用1日龄青农灰鹅180只，随机分为6个处理，每处理3重复，每重复10只。在玉米-豆粕型饲粮中分别添加0、600、1 200、1 800、2 400和3 000 mg/kg的胆碱。试验期15周。结果表明：1) 饲粮中添加胆碱能显著提高4、15周龄鹅免疫器官指数(P<0.05或P<0.01)，但对血清禽流感抗体效价无显著影响(P>0.05)。2) 饲粮未添加胆碱组鹅肝脏细胞肿大，胞浆内有较多大小不等的脂肪空泡，将细胞核挤压到一侧，添加1 200～3 000 mg/kg胆碱均可有效改善肝脏内脂肪的沉积现象。综合衡量各项指标，在饲粮中添加胆碱是可行的，胆碱添加水平均1 200 mg/kg为宜。

胆碱 鹅 免疫性能 肝脏组织学

胆碱(choline)是人和动物所必需的水溶性维生素，广泛分布于动植物组织中，具有重要的生理功能。胆碱是构成细胞膜磷脂和神经递质乙酰胆碱的组成成分，在维持细胞正常结构和功能，参与机体脂肪代谢，防止肝脏脂肪异常蓄积等过程中起着重要作用，同时还是生物体中重要的甲基供体[1-3]。Best等[4]发现，对大鼠饲喂低胆碱高脂肪的饲粮，补加胆碱后可阻止其诱发脂肪肝，证明胆碱是抑制肝脏脂肪沉积中卵磷脂的活性因子。研究表明，饲粮中添加适当胆碱显著降低肉仔鸡肝重和腹脂率，有效减少肝脏脂肪积累[5-7]。胆碱缺乏可导致Wistar大鼠肝细胞线粒体功能紊乱，发生脂质过氧化反应，引起细胞凋亡，造成氧化损伤[8-9]。Tsiagbe等[10]研究发现，日粮添加胆碱对肉仔鸡免疫反应无显著影响。迄今为止，家禽胆碱营养的研究主要集中在鸡、鸭等禽类，而鹅胆碱营养的研究报道较少，尤其鲜有胆碱对鹅免疫性能及肝脏组织学影响的相关报道。同时国内关于胆碱在鹅饲粮中的适宜添加量鲜见报道。因此，本试验以青农灰鹅为对象，研究不同水平胆碱对鹅免疫性能及肝脏组织学影响，旨在探讨胆碱对鹅免疫性能和脂质代谢的影响机制，为丰富我国鹅维生素营养研究数据，制订鹅的饲养标准提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料与基础饲粮

氯化胆碱：山东恩贝集团有限公司(氯化胆碱质量分数≥50%)。试验鹅基础饲粮以玉米和豆粕为主要原料，参照NRC(1994)家禽营养需要量中推荐的鹅饲粮营养水平设计配方[11]。全期分为0～4周龄，5～15周龄2个饲养阶段，2阶段基础饲粮中胆碱含量分别为920和911 mg/kg，基础饲粮组成及营养水平见表1。

表1 基础饲粮组成及营养水平(风干基础)

表1(续)

注：多维和微量元素为每kg饲粮提供 ：1～4周龄,VA 1 500 IU，VD3200 IU，VE 12.5 mg，VK31.5 mg，VB12.2 mg，VB25.0 mg，烟酸 65 mg，D-泛酸 15 mg，VB62 mg，生物素 0.2 mg，叶酸 0.5 mg，Fe 90 mg，Cu 6 mg，Mn 85 mg，Zn 85 mg，I 0.42 mg，Se 0.3mg。5～15周龄,VD3200 IU，VE 12.5 mg，VK31.5 mg，VB12.2 mg，VB25.0 mg，烟酸 65 mg，D-泛酸15 mg，VB62 mg，生物素 0.2 mg，叶酸 0.5 mg，Fe 85 mg，Cu 5 mg，Mn 80 mg，Zn 80 mg，I 0.42 mg，Se 0.3mg。 营养水平为计算值。

1.2 试验动物及设计

选择1日龄青农灰鹅180只，随机分为6个处理，每个处理3个重复，每个重复10只鹅。分别在6个处理组(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ)的基础饲粮中添加0、600、1 200、1 800、2 400和3 000 mg/kg的胆碱，试验期为2011年5月18日至9月1日，共15周。

1.3 饲养管理

试验鹅自由饮水和采食，全期舍饲，自配粉状混合料，少喂勤添。育雏期随时调节育雏温度：育雏前3周龄温度分别为28～30 ℃、26～27 ℃、24～25 ℃，3周龄后逐渐降到常温。1～2周龄光照23 h；3周龄光照18 h；4～15周龄采用自然光照。平均相对湿度65%。按常规程序进行免疫接种[1日龄小鹅瘟0.5 mL/只，8日龄鹅副黏二联灭活病毒疫苗0.4 mL/只，15日龄禽流感(H5/H9)二价灭活油苗0.4 mL/只，30日龄鹅禽流感(H5/H9)二价灭活油苗0.5 mL/只]。每天记录喂料量、温度、死淘数等相关数据，注意观察鹅的生长状况。

1.4 测定指标及方法

1.4.1 免疫性能指标

1.4.1.1 免疫器官指数的测定

于28、106日龄，每重复选取2只体重接近该组平均体重的鹅进行屠宰，切取胸腺、脾脏、法氏囊等免疫器官，去除脂肪后用滤纸吸干血水进行准确称重。按下式计算胸腺、脾脏和法氏囊指数：

免疫器官指数/mg/g=免疫器官重/活体重

1.4.1.2 禽流感抗体效价的测定

在接种鹅群禽流感疫苗后7、14、21、28 d，从各重复随机抽取2只试验鹅，翅静脉采血、分离血清，采用血凝和血凝抑制试验法(HA-HI)测定鹅禽流感抗体滴度。

1.4.2 肝脏组织切片的制作和比较

于106日龄，每重复选取2只体重接近该组平均体重的鹅，颈静脉放血处死，在肝脏最大叶距边缘8 mm处切取小块组织，生理盐水清洗后迅速放入10%甲醛固定液中，固定48 h，按常规组织切片制作要求，将固定的标本经水洗、脱水、透明、浸蜡、包埋、切片、染色等处理后，在室温下切成约6 μm厚的切片，苏木精-伊红染色法染色制成组织切片，光学显微镜下观察并拍片，进行肝脏组织学比较。

1.5 统计分析

采用SPSS17.0软件中单因素方差分析(One-Way ANOVA)，LSD法多重比较。试验数据以“平均数±标准差”表示。通过回归分析对剂量-效应关系作二次曲线拟合，根据二次方程计算最适添加量。P<0.05和P<0.01分别为差异显著和极显著水平。

2 结果

2.1 胆碱对鹅免疫性能的影响

2.1.1 胆碱对鹅免疫器官指数的影响

所有处理组鹅的免疫器官外观未见异常。由表2可知，4周龄时，胸腺、脾脏、法氏囊指数基本都呈现先升高后降低的趋势。Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ组胸腺指数均高于Ⅰ组，其中Ⅴ组极显著高于Ⅰ组(P<0.01)，显著高于Ⅵ组(P<0.05)，其他各组间均差异不显著(P>0.05)；脾脏指数中，Ⅰ组数值均低于其他各处理组，其中Ⅳ组极显著高于Ⅰ组(P<0.01)，显著高于Ⅱ、Ⅵ组(P<0.05)；法氏囊指数中，Ⅰ组均低于其他各处理组，其中Ⅲ组极显著的高于Ⅰ、Ⅱ、Ⅴ组(P<0.01)，显著高于Ⅳ、Ⅵ组(P<0.05)。通过回归分析，胸腺、脾脏、法氏囊指数与胆碱添加水平间的二次曲线关系不显著(R2<0.700)。

15周龄时，胸腺、脾脏指数也都呈现先升高后降低的趋势。其中Ⅴ组胸腺指数极显著高于Ⅰ、Ⅱ、Ⅵ组(P<0.01)，显著高于Ⅲ组(P<0.05)；Ⅳ组脾脏指数显著高于Ⅱ、Ⅲ、Ⅴ组(P<0.05)，极显著高于Ⅵ组(P<0.01)；Ⅰ、Ⅲ法氏囊指数显著高于其他各处理组(P<0.05)，且各处理组之间差异不显著(P>0.05)。通过回归分析，胸腺、脾脏指数与胆碱添加水平间的二次曲线关系不显著(R2<0.700)。

表2 饲粮中不同水平胆碱对青农灰鹅免疫器官指数的影响/mg/g

注：同一饲养阶段中同列数据肩标相同小写字母或无字母表示差异不显著(P>0.05)，相邻和相隔小写字母分别表示差异显著(P<0.05)和极显著(P<0.01)。下同。

2.1.2 胆碱对鹅禽流感抗体效价的影响

由表3可知，免疫后14、21、28日血清禽流感抗体效价呈先升高后降低趋势，且Ⅲ处理组抗体效价较高，但免疫后4个时期各处理组间血清抗体效价差异均不显著(P>0.05)。通过回归分析，拟合二次曲线得出，不同水平处理组胆碱与免疫后7、14、21、28日血清禽流感抗体效价二次关系不明显(R2<0.700)。

表3 饲粮中不同水平胆碱对青农灰鹅血清禽流感抗体效价的影响/log2

2.2 胆碱与鹅肝脏组织学观察

Ⅰ、Ⅱ组鹅肝脏表面呈红褐色，部分肝脏略有肿大，肝脏切面有油脂渗出。Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ组鹅肝脏均呈正常的红褐色，表面光滑，切面均无油脂渗出。H.E染色后，观察15周龄时青农灰鹅肝脏脂肪沉积情况(图1)，结果发现，Ⅰ组鹅部分肝脏细胞胀大变型，细胞内出现大量脂肪空泡，有部分油滴融合成了油囊，有的脂肪滴连成一片，将细胞核挤压到一侧，但肝细胞完整，未发现肝细胞严重受损(图1a)。Ⅱ组鹅肝细胞仍有大量脂肪空泡，但脂肪组织沉积量比Ⅰ组有所好转(图1b)。Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ组鹅肝脏呈现规则的肝细胞形态，细胞核清晰可见，部分细胞中有少量空泡，不影响肝细胞的大小和形态(图1c～图1f)。

图1 青农灰鹅肝脏组织学切片

3 讨论

3.1 胆碱对鹅免疫性能的影响

免疫器官指数和血清抗体效价是反映机体免疫性能的重要参考指标。胸腺、脾脏、法氏囊是家禽的主要免疫器官，其中法氏囊和胸腺属于中枢免疫器官，主要参与体液免疫，脾脏则与体内淋巴细胞参与细胞免疫，胸腺、脾脏和法氏囊的指数可用于评价雏鸡的免疫状况[12]。有研究表明，免疫器官指数降低是由于免疫抑制所致，而免疫器官指数增加则是免疫增强的表现[13]。禽流感抗体效价是反映机体禽流感免疫状态的指标。抗体效价的高低直接反映了机体的体液免疫状态，同时也表明动物体对疫病的抵抗力。Tsiagbe等[10]研究发现，向饲粮中添加不同水平胆碱，可促进肉仔鸡生长，但对机体免疫反应无显著影响。许丽[14]试验表明，在5日龄和20日龄分别给试验鸡滴眼接种新城疫疫苗，在28日龄试验结束时测得不同日粮处理间血清新城疫血凝抑制抗体效价(HI)差异不显著。本试验表明，随着饲粮胆碱添加水平的增加，各处理组胸腺、脾脏、法氏囊指数差异显著，且均呈现先升高后降低的趋势，但饲粮中胆碱添加水平对血清禽流感抗体效价差异不显著。综合考虑不同胆碱添加水平对各免疫器官指数和血清禽流感抗体效价的影响，并结合生产成本等方面的问题后得出，饲粮中添加1 200 mg/kg 胆碱即可满足鹅免疫性能的需要。饲粮中添加胆碱对鹅免疫器官的影响可能与胆碱是机体活性甲基的供体有关。有研究发现，胆碱的活性甲基可在脱氢酶的作用下释放出来，参与合成如蛋氨酸、肉碱、肌酸、磷脂、肾上腺素、DNA和RNA等具有重要生理功能的物质[15-18]。饲粮中胆碱的添加，提高了动物体内的甲基含量，增加半胱氨酸转化为蛋氨酸的循环次数，替代部分蛋氨酸，使更多的氨基酸用于体蛋白质的合成，提高了蛋白质的利用率[19]，促进免疫器官的发育，参与机体的合成代谢。同时胆碱作为甲基供体，间接参与肉碱合成，促进DNA复制，促进免疫器官细胞的增殖与分化，提高机体免疫功能。胆碱还是构成细胞膜和神经递质乙酰胆碱的组成成分，还可通过提高生物膜和神经系统的功能来间接的影响免疫器官生长发育。但关于胆碱对血清抗体效价影响不显著的原因尚不明确。鉴于国内外关于饲粮胆碱添加量对家禽免疫性能影响方面的研究报道较少，胆碱对鹅免疫水平的作用机理尚不明朗，有待于进一步深入探讨。

3.2 胆碱对鹅肝脏组织学影响

胆碱对降低动物肝脏脂肪沉积起着重要作用。基于目前对胆碱和蛋氨酸代谢的生化研究，胆碱氧化、蛋氨酸再甲基化和脂肪酸氧化三者的有机结合，共同构成了胆碱降低动物脂肪沉积的营养代谢途径[17]。王斯佳等[6]研究结果表明，胆碱和蛋氨酸对1～21日龄肉仔鸡的脂肪代谢影响显著，饲粮中添加适当胆碱可有效减少腹脂沉积以及肝脏中脂肪的积累。高立云等[20]研究结果显示，饲粮中添加胆碱可有效减少脏脏细胞内的脂肪空泡数量，肝细胞膜界限较清晰。本试验鹅肝脏组织学切片表明，饲粮中添加胆碱可有效减少青农灰鹅肝脏组织中脂肪沉积，防止肝脏脂肪的异常积累。这一结果与上述研究结果相一致，其原因可能是胆碱是甲基供体，通过合成卵磷脂，将脂肪以脂蛋白的形式运出肝脏，同时胆碱通过促进肉碱合成，提高机体细胞内脂肪酸氧化水平，促进机体内脂肪酸分解代谢而降低动物脂肪沉积[15,21]。当饲粮胆碱缺乏时，低密度脂蛋白形成相应减少，限制了底物的有效利用，并最终阻滞三酰甘油从肝细胞分泌，导致脂肪代谢异常，脂类在小肠中的吸收和转运受阻[22]。

4 结论

4.1 本试验条件下，饲粮添加胆碱能显著提高青农灰鹅免疫器官指数。从提高鹅的免疫性能和生产成本等方面考虑，饲粮胆碱适宜添加水平选择1 200 mg/kg。

4.2 饲粮添加胆碱能有效减少青农灰鹅肝脏脂肪沉积，当胆碱添加水平为1 200～3 000 mg/kg时，均可有效改善鹅肝脏脂肪沉积现象。

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Effects of Choline Added into Feed on Immune Function and Liver Histology of Geese

Zhang Wenxu1Wang Baowei2Mao Ke3Ge Wenhua2Zhang Mingai2Li Wenli1
(College of Animal Science and Technology,Qingdao Agricultural University1,Qingdao 266109)(Institute of High Quality Waterfowl, Qingdao Agricultural University2, Qingdao 266109)(Qingdao Vland Biotech Group Co.,Ltd.3, Qingdao 266061)

This experiment was conducted to study the effects of different choline level added into feed on immune function and liver histology of geese. One hundred and eighty one-day-old "Qingnonghui" geese were selected and randomly divided into 6 groups with 3 replicates in each group and 10 geese in each replicate. Geese in the six groups were fed the corn-soybean basal diets supplemented with 0, 600, 1 200, 1 800, 2 400 and 3 000 mg/kg choline, respectively. The experiment lasted for 15 weeks. The results showed as follows: 1) The supplementation of choline significantly increased immune organ index of geese aged 1 to 4 weeks and 1 to 15 weeks (P<0.05 orP<0.01), but there was no significant difference in antibody titre of Bird Flu disease(P<0.05). 2) in no choline group, swelling of hepatocyte was observed and the cytoplasm was full of fat cavitation, and the cell nuclei are squeezed to one side. The supplementation of 1 200～3 000 mg/kg choline in diets can decrease fat deposition of hepatocyte effectively. In conclusion, the supplementation of choline in diets for "Qingnonghui" geese is feasible, and the optimum supplemental level is 1 200 mg/kg.

choline, geese, immune function, liver histology

S835

A

1003-0174(2014)06-0069-05

国家水禽技术产业体系(CARS-43-11)，青岛市科技计划项目(11-2-3-23-nsh)

2013-06-28

张文旭，女，1987年出生，硕士，动物营养与饲料科学

李文立，男，1965年出生，教授，动物营养与饲料科学