间接竞争ELISA法检测谷物中T-2毒素

唐世云 武玉香 曲光刚 付石军 沈志强

(山东省滨州畜牧兽医研究院1，滨州 256600)(山东绿都生物科技有限公司2，滨州 256600)

间接竞争ELISA法检测谷物中T-2毒素

唐世云1武玉香2曲光刚1付石军1沈志强1

(山东省滨州畜牧兽医研究院1，滨州 256600)(山东绿都生物科技有限公司2，滨州 256600)

T-2 毒素是单端孢霉烯族毒素的重要代表，在单端孢霉烯族毒素中毒性最强，是主要的食品污染源之一，用间接竞争酶联免疫分析法(ELISA)对谷物中的T-2毒素进行了测定。从样品的处理、T-2毒素的添加回收及ELISA的实验检测等方面进行试验，最终结果用分析软件分析相关数据得到相关系数为0.998，IC50为1.3 μg/kg，标准品浓度为0～16.2 μg/kg，灵敏度为0.2 μg/kg，添加回收率均大于90%。该法测定T-2毒素方法简便，特异性高，灵敏度高，重复性好，适合用于检测谷物中的T-2毒素。

间接竞争酶联免疫分析 T-2毒素 谷物

T-2毒素主要是三线镰刀菌产生的单端孢霉烯族化合物(trichothecenes，TS)之一。它广泛分布于自然界，是常见的污染田间作物和库存谷物的主要毒素，对人、畜危害较大[1]。

1973年联合国粮农组织(FAQ)和世界卫生组织(WHO)在日内瓦召开的联席会议上，把这类毒素同黄曲霉毒素一样作为自然存在的最危险的食品污染源。人畜误食污染有T-2 毒素的谷物后，可引起急性中毒，危及人们的生命安全和身体健康[2-3]。该病是一种非常严重的常引起死亡的人类真菌毒素中毒症[4-5]。T-2毒素由Bamburg于1968年首次分离提纯并确认了化学结构。T-2毒素为白色针状结晶，镰刀菌在谷物上适宜繁殖温度为16～24 ℃，相对湿度为85%；如在土壤中则分别为12～24 ℃和40%～60%。凡适合此菌生长繁殖的地区的玉米、麦类、稻谷、豆类、薯类等作物上均易感染此菌[6]。近年有研究提出，T-2毒素对食用粮(小麦、玉米)的污染导致了另一种地方病——大骨节病(KBD)的发生[7]。

T-2毒素对不同动物的毒性有一定种属差异，新生或未成年动物比成年动物对毒素更敏感。亚急性和慢性毒性作用可导致骨髓和淋巴组织坏死、溶解，外周血干细胞减少和淋巴细胞严重缺乏[8]。为此我国对饲料中的T-2毒素的允许量做出了规定，如表1所示。

表1 GB 21693—2008 配合饲料中T-2毒素的允许量

现在T-2毒素主要的检测方法为液相色谱法(LC)、气相色谱法(GC)及免疫法等。酶联免疫吸附分析法(ELISA)具有样品前处理简单、快速方便、特异性和灵敏度高且不需要昂贵的仪器设备等特点，比较适合推广普及可以进行定性和定量测定，大大节约了测试成本，因而ELISA法可以广泛用于T-2毒素的测定[9]。

1 材料与方法

1.1 试剂与材料

T-2毒素与载体蛋白-牛血清白蛋白的结合物(T-2-BSA)、T-2毒素单克隆抗体：山东绿都生物科技有限公司；辣根过氧化酶(HRP)：北京赛弛生物科技有限公司；T-2毒素标准品：北京华安麦科生物技术有限公司；四甲基联苯胺(TMB)：上海紫一试剂厂；牛血清白蛋白(BSA)：广州蕊特生物科技有限公司； 96孔酶标板：上海研谨生物科技有限公司；其他化学药品均为分析纯；谷物(小麦、玉米、小米、大米)：本地农贸市场。

1.2 仪器与设备

TDL-40B台式离心机：上海安亭科学仪器厂；MK3型酶标仪：美国Thermo公司； JE1002型电子天平：上海浦春计量仪器有限公司；QL-866振荡器：海门市其林贝尔仪器制造有限公司；DRP-9272型电热恒温培养箱：上海森信实验仪器有限公司；Genex Beta单道和多道微量移液器：荷兰百得公司；离心管：海门博阳实验器材厂。

1.3 试验方法

1.3.1 试验原理

采用间接竞争ELISA法检测样本中T-2毒素含量。酶标板微孔内预先包被有T-2毒素的抗原，加入标准液或样本、酶标记物、T-2毒素抗体后，样本或标准液中的T-2毒素抗原和微孔内包被的偶联抗原竞争结T-2毒素抗体，用底物液显色，样本和标准液中的T-2毒素含量与吸光度值呈反比，与标准曲线比较即可得出T-2毒素含量。

1.3.2 酶标板的包被

将T-2毒素的抗原用包被缓冲液(pH 9.6 0.05 mol/L碳酸盐缓冲液)稀释，包被到酶标板微孔中，每孔100 μL，4 ℃过夜。

酶标板用洗涤液洗涤3次，加封闭液封闭2 h后烘干保存备用。

1.3.3 ELISA溶液的制备

样品提取液80%甲醇，包被缓冲液为pH 9.6的碳酸盐缓冲液；洗液为含0.05%吐温-20的pH 7.4的磷酸盐缓冲液(PBS)；底物缓冲液为pH 5.0的磷酸-柠檬酸缓冲液；底物A：称取TMB 17.2 mg，加DMSO 1 mL溶解，然后加醋酸钠缓冲液(0.1 mol/L，pH 5.5)66 mL；底物B：取双蒸水100 mL，加30% H2O217 μL；终止液：2 mol/L硫酸。

1.3.4 标准品配制

用10%甲醇将T-2毒素标准品依次配成0、0.2、0.6、1.8、5.4、16.2 μg/kg 6个浓度，作为标准品的浓度。

1.3.5 样品处理

称取粉碎谷物样品(小麦、玉米、小米、大米)(2.0±0.05)g至离心管中，加入30 mL样品提取液， 震荡提取1 min；4 000 r/min离心5 min；小心移取上清液100 μL 加到900 μL 1×T-2毒素谷物稀释液中混匀，取50 μL用于分析。稀释倍数为150倍。

1.3.6 样品测定

将所需试剂从冷藏环境中取出，待其完全回升至室温(20～25 ℃)后方可使用。注意每种液体试剂使用前均须摇匀。

加标准品/样品、酶、抗体：加标准品/样品50 μL到对应的微孔中，加入T-2毒素酶标物50 μL/孔， 再加入T-2毒素抗体50 μL/孔，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置37 ℃避光环境中反应20 min。

洗板：小心揭开盖板膜，将孔内液体甩干，加入洗涤工作液250 μL/孔，每次静置20 s，甩去孔内液体，重复洗涤3次，最后一次用吸水纸拍干。

显色：加入底物液A液50 μL/孔，再加底物液B液50 μL/孔，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置37 ℃避光环境中反应10 min。

测定：加入终止液50 μL/孔，用酶标仪立即测定450 nm处的吸光度值(建议用双波长450/630 nm)检测。

1.3.7 数据处理

Ridasoft .win软件作为ELISA方法结果分析软件，操作简单易行，只需将数据输入软件，就可以自动进行数据分析，解决了数据处理烦琐的问题。现将原始吸光度值及标准品的浓度按软件的要求输入到电脑中，点击软件中的不同图标可以得到不同的曲线，ELISA分析中常用的是拟合曲线及标准曲线。试验数据用软件处理后，不但可以看到试验数据是否理想，还可以直接得出试验样品中的T-2毒素含量，非常方便，省去了烦琐的计算。

2 结果与讨论

2.1 函数曲线的绘制

以标准品百分吸光率为纵坐标，以T-2毒素标准品浓度(μg/kg)为横坐标，绘制函数曲线图,如图1。将样本的百分吸光率代入曲线中，从曲线上读出样本所对应的浓度，乘以其对应的稀释倍数即为样本中T-2毒素实际浓度。以logit/log 作图，logit为纵坐标，T-2毒素标准品浓度为横坐标， logit= ln (p/q)，p=B/B0，q=1-p， 标准曲线如图2，其中B为不同浓度标准品的吸光值，B0为标准品浓度为0时的吸光值。

图1 拟合曲线

图2 标准曲线

由拟合曲线和标准曲线可以看出，在0～16.2 μg/kg含量范围内，T-2毒素标准品曲线有良好的线性关系，线性方程为：y=-1.9x+1.8，相关系数为0.998，IC50为1.3 μg/kg(拟合曲线得到的IC50是根据实际数据得到的，标准曲线的IC50值经过修正，故确定1.3 μg/kg为最终的IC50)。经计算得知，当T-2毒素质量浓度达到0.2 μg/kg时，抑制率为19.3%，可以确定T-2毒素间接竞争ELISA法检测的灵敏度为0.2 μg/kg 。

2.2 谷物中T-2毒素含量的测定结果

每个样品取2个平行样品，按同一方法处理、测定，测定结果见表2。

表2 谷物中T-2毒素含量的测定结果

酶标仪读出吸光值后输入Ridasoft .win软件， 从软件的分析结果中直接可以得到最终样品中的T-2毒素的含量。从结果中可以看到，T-2毒素在谷物中的含量远远低于目前在饲料中的限量标准(≤1 mg/kg)，也低于以色列等国规定的谷物饲料中的限量值(≤100 μg/kg)，可以认为市场采购的这些谷物是安全的。

2.3 添加回收试验

选玉米样品，分别加入质量浓度为30、80 μg/kg的T-2毒素标准品；选小麦样品，分别加入浓度为4、6 μg/kg的T-2毒素标准品。按1.3.5样品处理方法并测定，样品做2个平行，同时测定样品空白对照，计算回收率。结果如表3所示，玉米样品的添加回收率分别为92.3%和93.6%，小麦样品的添加回收率在95.0%和93.3%，符合方法的要求(要求回收率70%～120%)说明该方法回收效率较高，重现性好。

表3 T-2毒素回收率试验结果

3 结论

用该ELISA快速检测方法检测谷物中T-2毒素的含量，样品前处理简单，适用范围广；标准品含量在0～16.2 μg/kg含量范围内线性关系良好，线性关系达到0.998，具有较高的灵敏度；添加回收率均在90%以上，重复性好，满足分析的要求。间接竞争ELISA检测法耗时短(总耗时约1 h)，为准确测定谷物、饲料及其原料中T-2毒素的含量提供了简便有效方法。

[1]王敏辉,李吕木,丁小玲.T-2毒素研究进展[J].动物营养学报，2011，23(1)：20-24

[2]Bamburg J R，Strong F M.12,13-E-poxytrichothecenes[M]//Kadis S,et al.Algal and fungal toxins.New York:Academic Press.Inc.，1971，7：207-292

[3]Ueno Y.Trichothecenes:overview address[M]/Rodricks J V,Hesseltine C W,Mehlman M A.Mycotoxins in human and animal health，Pathotox Publishers,Inc.,Park Forest South,Ill，1977：189-207

[4]Croft W A.Ariboren outbreak of trichothecene toxicosis[J].Atmospheric Environment，1986，20(3)：549-552

[5]Kupchan S M,Streelman D R,Jarvis B B,et al.Isolation of potent new antileukemic trichothecenes fromBaccharismegapotamica[J].Journal of Organic Chemistry，1977，42(26)：4221-4225

[6]杨建伯,孙殿军,王志武.大骨节病病区病户主食中T-2毒素检出报告[J].中国地方病学杂志，1995，14(3)：146-149

[7]阳传和,罗雪云,计融,等.小麦中T-2 毒素的污染调查[J].微生物学报，1992，32(6)：450-455

[8]冯杏婉,赵修南,李凤仙,等.T2毒素对小鼠外周血象和骨髓造血干、祖细胞的作用[J].中国药理学与毒理学杂志，1989，3(2)：144-148

[9]林妮妮,赵燕华,郭磊,等.T-2毒素的分析检测方法及代谢研究进展[J].军事医学,2012 ,36(6):471-475.

Indirect Competitive ELISA Method for Detecting T-2 Toxin in Cereals

Tang Shiyun1Wu Yuxiang2Qu Guanggang1Fu Shijun1Shen Zhiqiang1
(Shandong binzhou animal science and veterinary medicine academy1, Binzhou 256600)(Shandong Lvdu Biotechnology Co., Ltd.2Binzhou 256600)

T-2 toxin is one of the important representatives of trichothecenes and also the most toxic element amoung trichothecenes. It has been one of the major pollution sources of food. T-2 toxin in cereal has been determined by indirect competitive enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). The study included sample treatment, the addition and recycling of T-2 toxin, the detection of ELISA assay and so on. The data of analysis software showed that the linear correlation coefficient was 0.998, IC50of 1.3 μg/kg, standard concentration of 0～16.2 μg/kg, sensitivity of 0.2 μg/kg and recover rate of above 90%. The determination method of T-2 toxin has advantages; it si simplewith high specificity, high sensitivity, good repeatability and is suitable for detecting T-2 toxin in cereals.

indirect competitive ELISA, T-2 toxin, cereals

S51

A

1003-0174(2014)06-0118-04

2013-06-23

唐世云，男，1974年出生，助理研究员，食品加工与安全

沈志强，男，1963年出生，研究员，预防兽医学研究与开发