萘乙酸对冬季迟缓期的艾纳香生长和有效成分含量的影响

2015-01-06 02:42王丹马青松范佐旺李小婷宛骏张影波庞玉新
广东药科大学学报 2015年5期
关键词:艾纳香萘乙酸龙脑

王丹,马青松,范佐旺,李小婷,宛骏,张影波,庞玉新

药物分析

萘乙酸对冬季迟缓期的艾纳香生长和有效成分含量的影响

王丹,马青松,范佐旺,李小婷,宛骏,张影波,庞玉新

(中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所/海南省艾纳香工程技术研究中心,海南儋州571737)

目的研究萘乙酸对冬季迟缓期艾纳香生长和有效成分质量分数的影响。方法以一年生艾纳香种子苗为试验材料,在冬季艾纳香生长迟缓期进行3次喷施萘乙酸。测定艾纳香的株高、地径、叶长和叶宽等生长指标以及生物量。采用紫外-可见分光光度法测定艾纳香不同部位中总黄酮的相对含量,并计算总黄酮的绝对含量。采用GC法测定艾纳香叶片中l-龙脑的相对含量,并计算其绝对含量。结果萘乙酸可以显著促进艾纳香生长,尤其是叶片干质量的积累,其中10 mg/L萘乙酸处理组的叶片干质量最高,为134.73 g,分别是1、100 mg/L萘乙酸和CK处理组的1.70、2.01和7.71倍。不同质量浓度的萘乙酸对艾纳香叶片中总黄酮和l-龙脑影响各不相同。1 mg/L萘乙酸和CK处理组的总黄酮相对含量最高,显著高于其他处理组,并且1 mg/L萘乙酸处理组的总黄酮绝对含量最高。CK处理组的l-龙脑相对含量最高,而10 mg/L萘乙酸处理组的艾纳香叶片中l-龙脑绝对含量最高。结论在冬季艾纳香生长迟缓期施加萘乙酸可以显著促进艾纳香生长和叶片干质量的增加,提高总黄酮和l-龙脑的绝对含量。

萘乙酸;艾纳香;迟缓期;l-龙脑;总黄酮

艾纳香为菊科(Asteraceae)植物艾纳香Blumea balsamifera(L.)DC.的新鲜或干燥地上部分,具有祛风除湿、温中止泻、活血解毒等功效,广泛分布于我国的海南、贵州、云南等省。艾纳香中主要含有挥发油类、黄酮类以及倍半萜类等成分,其主要成分为l-龙脑(l-borneol)[1-3]。艾纳香作为天然艾片、艾粉、艾纳香油的原料来源,越来越受到人们的青睐,市场需要量不断增加[4];因此,获得高产和高质量的艾纳香才能充分满足市场的需求。施肥是提高药材产量和质量的有效途径[5],但在艾纳香道地产区贵州省罗甸等地很少对栽培艾纳香施肥或仅施少量钙镁磷肥。目前与艾纳香施肥相关的研究尚不多,何元农等[6]对艾纳香施用农家肥圈肥、油枯和柴灰,以及尿素、过磷酸钙、氯化钾和复合肥等,结果表明施肥组的经济产量和生物产量高于对照组,且有效成分质量分数不减。其中氮肥对生物产量增加作用明显,得油率和l-龙脑质量分数与钾肥用量呈正相关关系。何元农等[7]研究证实氮肥可以提高艾纳香药材的产量和有效成分的质量分数。王丹等[8]研究发现锰元素极显著地提高冬季生长迟缓期的艾纳香生长指标和生物量,对l-龙脑和总黄酮的相对质量分数的提高无明显影响,但是极显著地提高了其绝对质量分数,即单株质量。

萘乙酸是一种人工合成的植物生长调节剂,具有与生成素类似的生理效应。它可以刺激植物生长、插枝生根,诱导植物开花、抑制抽芽和落花落果,促进作物早熟和增产等,被广泛应用在农、林、园艺业等领域[9-10]。目前,萘乙酸在药用植物栽培方面的应用研究较少,仅在山茱萸[11]、何首乌[12]、金银花[13]和走马胎[14]等少数品种有初步研究,尚未见应用于艾纳香的肥效研究。本研究在海南冬季艾纳香生长的迟缓期,进行不同质量浓度的萘乙酸对艾纳香生长指标、生物量以及有效成分相对含量和绝对含量影响的肥效研究,为该药材实际生产中的系统和合理施肥提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

选择一年生艾纳香种子苗,经中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所庞玉新副研究员鉴定为艾纳香Blumea balsamifera(L.)DC.。2013年3月进行播种育苗后,2013年5月选择生长情况一致的种子苗移栽到大田,按照株距1 m×1 m移栽。艾纳香幼苗生长于中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所冰片加工厂区内。于2014年1月27日开始,每隔10 d进行艾纳香叶面喷施萘乙酸,共施肥3次。于3月7日进行取样。分别设置1、10和100 mg/L 3个质量浓度萘乙酸处理组,另设空白对照组(CK),不进行任何处理。

1.2 仪器与试剂

7890A气相色谱仪(美国安捷伦科技公司),FID氢火焰离子化检测器(美国安捷伦科技公司),G4513A 16位自动进样器(美国安捷伦科技公司),2012-PCS紫外分光光度计[尤尼柯(上海)仪器有限公司],CPA225D电子分析天平(北京赛多利斯天平有限公司),KQ-500DB型超声仪(昆山市超声仪器有限公司)。

左旋龙脑对照品(阿法埃莎化学有限公司,批号为10147015,质量分数>98%),芦丁对照品(中国药品生物制品检定所,批号为100080-200707,质量分数为92.5%);水杨酸甲酯(天津光复精细化工研究所),乙酸乙酯、甲醇、NaOH(西陇化工股份有限公司),NaNO2(国药集团化学试剂有限公司),Al(NO3)3·9H2O(广州化学试剂厂),萘乙酸(国药集团化学试剂有限公司)均为国产分析纯。

1.3 生长指标的测定

用直尺和卷尺分别测量艾纳香株高、叶长和叶宽,使用电子游标卡尺测量地径,取艾纳香的叶片阴干后用天平称叶干质量。

1.4 总黄酮相对含量和绝对含量的测定[8]

1.4.1 对照品溶液的制备 精密量取芦丁对照品约10 mg,置50 mL量瓶中,加入适量甲醇,置水浴上微热使溶解,放冷,加甲醇至刻度,摇匀,得质量浓度为0.227 6 mg/mL的对照品溶液。

1.4.2 标准曲线的绘制 分别精密量取对照品溶液1、2、3、4、6、8 mL,分别置于25 mL容量瓶中,各加水至10.0 mL,加5%(质量浓度,下同)NaNO2溶液1 mL,摇匀,放置6 min;加10%(质量浓度,下同) Al(NO3)3溶液1 mL,摇匀,放置6 min;加4%(质量浓度,下同)NaOH溶液10 mL,加水定容至刻度,摇匀,放置15 min,以相应试剂溶液为空白,于500 nm处测定吸光度(A)。以质量浓度(ρ)为横坐标,A为纵坐标绘制标准曲线,得回归方程A=12.102ρ-0.000 9 (R2=0.999 7),线性范围为0.010 4~0.082 8 mg/mL。按照精密度、稳定性、重复性和加样回收试验进行方法学考察,结果表明方法稳定、准确、重复性好。

1.4.3 供试品溶液的制备 精密称取艾纳香叶(过筛径为850 mm筛子)粉末1.000 0 g,至具塞锥形瓶中,加甲醇50 mL,称定质量,冷浸30 min后,超声提取(频率80 kHz)30 min,放冷,再称定质量。用甲醇补足减失的质量,摇匀后滤过,取续滤液,即得。

1.4.4 总黄酮相对含量的测定 进行供试品溶液吸光度值测定,根据线性方程计算得出艾纳香叶片总黄酮的相对含量。艾纳香叶片总黄酮相对含量是指100个单位质量的艾纳香叶片中所含总黄酮的单位质量数,单位为%。

1.4.5 总黄酮绝对含量的计算 总黄酮的绝对含量为艾纳香总黄酮产量,即艾纳香叶片所含总黄酮的质量。

总黄酮绝对含量=叶片中总黄酮相对含量/100×叶片生物量,单位为g。

1.5 左旋龙脑质量分数的测定

1.5.1 色谱条件 HP-5石英毛细管色谱柱(0.32 mm ×30 m,0.25 μm);以80℃为起始温度,保持2 min,然后以5℃/min升温至100℃,再以20℃/min升温至200℃;进样口温度为220℃;FID检测器温度为240℃;进样量0.6 μL,分流比为9∶1。左旋龙脑对照品和艾纳香供试品溶液的GC色谱图见图1。

1.5.2 供试品溶液的制备 取艾纳香叶片粉末(过筛径为850 mm筛子)约2 g,精密称定,置于50 mL具塞三角瓶中,加入乙酸乙酯25 mL,称定质量,在40 kHz超声条件下提取30 min,放冷,用乙酸乙酯补足减失的质量,摇匀,静置,经0.22 μm微孔滤膜滤过,取续滤液即得。

图1 l-龙脑对照品(A)、艾纳香叶片供试品(B)溶液的GC色谱图Figure 1 The GC chromatogram of solution of l-borneol reference substance(A)and leaf sample in B.balsamifera(B)

1.5.3 线性关系的考察 取左旋龙脑对照品约100 mg,精密称定,加乙酸乙酯定容至100 mL作为对照液。取水杨酸甲酯约250 mg,精密称定,加乙酸乙酯定容至250 mL作为内标溶液。分别精密量取对照液0.1、0.2、0.5、1.0、2.0 mL置于10 mL容量瓶中,分别加入内标溶液1.0 mL,以乙酸乙酯定容至刻度,即得系列混合对照品溶液,按照“1.5.1”项下色谱条件测定。以对照品中左旋龙脑质量浓度(mg/mL)为横坐标(X),对照品左旋龙脑与内标物水杨酸甲酯的峰面积比为纵坐标(Y)绘制标准曲线,得到线性回归方程为Y=14.823 X+0.012 9,R2=0.999 9,结果表明左旋龙脑在0.010~0.207 mg/mL与峰面积呈良好的线性关系。

1.5.4 精密度试验 取CK处理组艾纳香叶片,按“1.5.2”项下方法制备供试品溶液,按“1.5.1”项下色谱条件重复进样6次,记录色谱图。结果左旋龙脑与水杨酸甲酯的相对峰面积的RSD值为2.1%,表明仪器精密度良好。

1.5.5 重复性试验 取CK处理组艾纳香叶片5份,按“1.5.2”项下方法制备供试品溶液,按“1.5.1”项下色谱条件进样分析,结果测得左旋龙脑质量分数的RSD值为3%,表明方法重复性良好。

1.5.6 稳定性试验 取CK处理组艾纳香叶片1份,按“1.5.2”项下方法制备供试品溶液,于室温下放置,分别在0、2、4、8、12、24 h各进样测定,左旋龙脑与内标物的相对峰面积的RSD为0.49%,表明供试品在24 h内稳定性良好。

1.5.7 加样回收率试验 取已知质量分数的CK处理组艾纳香叶片粉末约1 g,精密称定,共6份。每份样品精密加入左旋龙脑对照品约5 mg,按“1.5.2”项下方法制备供试品溶液,按“1.5.1”项下色谱条件进样分析,结果得回收率在95%~105%之间,RSD值为2.44%,表明回收率较高。

1.5.8 l-龙脑相对含量的测定 按照“1.5.2”项下方法制备供试品溶液,按“1.5.1”项下色谱条件进样分析,根据线性方程计算艾纳香叶片中l-龙脑的相对含量。艾纳香叶片中l-龙脑相对含量是指100个单位质量的艾纳香叶片中所含l-龙脑的单位质量数,单位为%。

1.5.9 l-龙脑绝对含量的计算 l-龙脑的绝对含量为艾纳香中l-龙脑产量,即单株艾纳香叶片所含l-龙脑的质量。

l-龙脑绝对含量=叶片中l-龙脑相对含量/100×叶片生物量,单位为g。

1.6 数据分析

采用Excel进行数据录入及图表的绘制,采用SPSS 16.0软件进行统计与One-way ANOVA方差分析,并用Duncan检验法进行多重比较。

2 结果与分析

2.1 萘乙酸对艾纳香生长指标的影响

萘乙酸对艾纳香生长指标的影响方差分析结果见表1。结果表明,不同质量浓度萘乙酸处理组,艾纳香株高在各处理间差异有统计学意义(P<0.05),地径、叶长和叶宽在各处理间差异亦具有统计学意义(P<0.01)。由表1可见,萘乙酸对艾纳香叶长、叶宽增加的促进作用很明显,1、10和100 mg/L萘乙酸处理组的叶长、叶宽分别是CK处理组的2.94、3.13、2.72倍和3.89、4.00、3.41倍。

表1 萘乙酸对艾纳香生长指标的影响Table 1 The effect of naphthylacetic acid on growth index of Blumea balsamifera(±s,n=6)

表1 萘乙酸对艾纳香生长指标的影响Table 1 The effect of naphthylacetic acid on growth index of Blumea balsamifera(±s,n=6)

注:相同字母表示比较组间差异无统计学意义,不同字母表示比较组间差异有统计学意义(P<0.05)。

组别生长指标株高/cm 地径/mm 叶长/cm 叶宽/cm 1 mg/L萘乙酸组 34.65±3.44a11.04±0.33a22.69±0.97a7.86±0.53a10 mg/L萘乙酸组 38.66±8.09a12.05±0.61a24.19±1.93a8.10±0.58a100 mg/L萘乙酸组 30.28±2.57ab10.95±1.12a21.00±3.01a6.88±0.97aCK组 22.57±1.33b5.35±1.07b7.73±2.46b2.02±0.89b

2.2 萘乙酸对艾纳香叶片干质量的影响

萘乙酸对艾纳香叶片干质量的影响方差分析结果见表2。结果表明,不同质量浓度的萘乙酸处理组,艾纳香叶片干质量在各处理间差异均具有统计学意义(P<0.01)。10 mg/L萘乙酸处理组的叶片干质量最高,为134.73 g,分别是1、100 mg/L萘乙酸和CK处理组的1.70、2.01和7.71倍。1、100 mg/L萘乙酸处理组的叶片干质量明显高于CK处理组,分别是其4.54和3.83倍。

表2 萘乙酸对艾纳香叶片干质量的影响Table 2 The effect of naphthylacetic acid on leaf biomass of Blumea balsamifera(±s,n=6)

表2 萘乙酸对艾纳香叶片干质量的影响Table 2 The effect of naphthylacetic acid on leaf biomass of Blumea balsamifera(±s,n=6)

注:相同字母表示比较组间差异无统计学意义,不同字母表示比较组间差异有统计学意义(P<0.05)。

组别 叶干质量/g 1 mg/L萘乙酸组 79.34±12.30b10 mg/L萘乙酸组 134.73±19.84a100 mg/L萘乙酸组 67.02±16.66bCK组 17.48±2.92c

2.3 萘乙酸对艾纳香叶片中总黄酮的影响

萘乙酸对艾纳香叶片中总黄酮相对含量影响的方差分析结果见表3。结果表明,不同质量浓度的萘乙酸处理组,艾纳香叶片中总黄酮相对与绝对含量差异均具有统计学意义(P<0.01)。1 mg/L萘乙酸和CK处理组的总黄酮相对含量最高,分别为2.34%和2.24%,明显高于10和100 mg/L萘乙酸处理组。1 mg/L萘乙酸处理组的总黄酮绝对含量最高,为1.83 g,高于10、100 mg/L萘乙酸和CK处理组,分别是其1.37、2.54和4.69倍。

表3 萘乙酸对艾纳香叶片中总黄酮的影响Table 3 The effect of naphthylacetic acid on total flavones contents of Blumea balsamifera(±s,n=6)

表3 萘乙酸对艾纳香叶片中总黄酮的影响Table 3 The effect of naphthylacetic acid on total flavones contents of Blumea balsamifera(±s,n=6)

注:相同字母表示比较组间差异无统计学意义,不同字母表示比较组间差异有统计学意义(P<0.05)。

组别 w(总黄酮)/% m(总黄酮)/g 1 mg/L萘乙酸组 2.34±0.32a1.83±0.03a10 mg/L萘乙酸组 1.01±0.18b1.34±0.12b100 mg/L萘乙酸组 1.12±0.30b0.72±0.07cCK组 2.24±0.19a0.39±0.04d

2.4 萘乙酸对艾纳香叶片中l-龙脑的影响

萘乙酸对艾纳香叶片中l-龙脑含量影响的方差分析结果见表4。结果表明,不同质量浓度的萘乙酸处理组,艾纳香叶中l-龙脑的相对含量和绝对含量在各处理间差异有统计学意义(P<0.01)。CK处理组的l-龙脑相对含量最高,为0.16%,分别比1、10 和100 mg/L萘乙酸处理组高33.33%、77.78%和128.57%。而10 mg/L萘乙酸处理组的艾纳香叶片中l-龙脑绝对含量最高,明显高于1、100 mg/L萘乙酸和CK处理组,分别为其1.20、3.00倍和4.00倍。

表4 萘乙酸对艾纳香叶片中l-龙脑的影响Table 4 The effect of naphthylacetic acid on l-borneol contents of Blumea balsamifera(±s,n=6)

表4 萘乙酸对艾纳香叶片中l-龙脑的影响Table 4 The effect of naphthylacetic acid on l-borneol contents of Blumea balsamifera(±s,n=6)

注:相同字母表示比较组间差异无统计学意义,不同字母表示比较组间差异有统计学意义(P<0.05)。

组别 w(l-龙脑)/% m(l-龙脑)/g 1 mg/L萘乙酸组 0.12±0.02b0.10±0.02b10 mg/L萘乙酸组 0.09±0.02bc0.12±0.004a100 mg/L萘乙酸组 0.07±0.01c0.04±0.002cCK组 0.16±0.01a0.03±0.006c

3 讨论

何元农等[15]研究发现1~2月是艾纳香生长迟缓期,3月为生长恢复期。本研究在海南冬季即艾纳香生长迟缓期进行萘乙酸对艾纳香的肥效研究。未进行任何处理的CK组,艾纳香生长缓慢,甚至停止生长。施加不同质量浓度的萘乙酸可以显著促进艾纳香植株的生长,提高株高、地径、叶长和叶宽等生长指标,尤其是显著增加了叶干质量,其中10 mg/L萘乙酸处理组的叶干质量最高,为134.73 g,分别是1、100 mg/L萘乙酸和CK处理组的1.70、2.01和7.71倍,这与萘乙酸在大多数作物上的研究结果相同[16-20]。田丽岩等[17]研究发现不同质量浓度的萘乙酸营养液可以提高丁香幼苗的成活率,促进幼苗根茎伸长、真叶分化,这一结果主要是由于萘乙酸作为一种生长素,通过ATPase的活性促进将质子送到质膜外,进而细胞壁酸化,导致细胞壁中的不稳定的键打断;此外,生长素还可以促进水解酶的活性,导致细胞壁纤维结构间交接点键的打开[21]。同时,本研究结果表明,不同质量浓度的萘乙酸对艾纳香中总黄酮和l-龙脑的积累影响有差异。1 mg/L萘乙酸和CK处理组的总黄酮相对含量最高,显著高于其他处理组,且1 mg/L萘乙酸处理组的总黄酮绝对含量最高。但从l-龙脑含量来看,CK处理组的l-龙脑相对含量最高,而10 mg/L萘乙酸处理组的艾纳香叶片中l-龙脑绝对含量最高。目前,有关萘乙酸对植物次生代谢调控的直接影响机制尚未有报道;间接影响的产生,可能主要是因为萘乙酸影响艾纳香的初生代谢,而初生代谢产物是次生代谢过程的基础[22]。目前,有关萘乙酸对药用植物生长尤其是药效成分积累影响的相关研究报道较少,本研究为萘乙酸等植物生长激素在药用植物上的应用提供了数据支持和指导价值。

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(责任编辑:刘晓涵)

Effect of naphthylacetic acid on growth and contents of effective constituents in Blumea Balsamifera(L.)DC.in slow growth period of winter

WANG Dan,MA Qingsong,FAN Zuowang,LI Xiaoting,WAN Jun,ZHANG Yingbo,PANG Yuxin
(Tropical Crops Genetic Resources Institute,Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences/Hainan Provincial Engineering Research Center for Blumea Balsamifera,Danzhou 571737,China)

ObjectiveTo investigate the effect of naphthylacetic acid on growth and contents of effective constituents in Blumea balsamifera(L.)DC.in slow growth period of winter.MethodsThe one-year-old seedlings of B.balsamifera were treated with naphthylacetic acid in slow growth period of winter for three times.The height,ground diameter,length of leaf,width of leaf and biomasses were measured.Then,the relative contents of total flavones in different parts were determined by UV and the absolute contents of total flavones were calculated.The relative contents of l-bornel in leaves were determined by GC and the absolute contents of l-bornel were calculated.ResultsNaphthylacetic acid significantly promoted the growth of B. balsamifera,especially increased leaf biomass.The leaf biomass under 10 mg/L naphthylacetic acid treatment was the highest with 134.73 g,which was 1.70,2.01 and 7.71 times than that under 1,100 mg/L naphthylacetic acid and CK treatments.The different concentrations of naphthylacetic acid showed various effects on total flavones and l-borneol accumulations.The relative contents of total flavones were the highestunder 1 mg/L naphthylacetic acid and CK treatments.Then,the absolute content of total flavones under 1 mg/L naphthylacetic acid treatment was the highest.However,the relative content of l-borneol under CK treatment was the highest,and the absolute content of l-borneol under 10 mg/L naphthylacetic acid treatment was the highest.ConclusionThe naphthylacetic acid could significantly promote the growth and the accumulation of leaves,as well as the absolute contents of total flavones and l-borneol in B.balsamifera in slow growth period of winter.

naphthylacetic acid;Blumea balsamifera;slow growth period;l-borneol;total flavones

R284.1

:A

10.3969/j.issn.1006-8783.2015.05.008

1006-8783(2015)05-0592-05

2015-04-02

国家自然科学基金项目(81403035)

王丹(1982—),女,博士,副研究员,Email:wang_dan1414@163.com;通信作者:庞玉新(1975—),男,博士,副研究员,主要从事南药资源研究与开发利用,Email:blumeachina@126.com。

时间:2015-10-16 15:26

http://www.cnki.net/kcms/detail/44.1413.R.20151016.1526.002.html

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紫外分光光度法测定氯化胆碱·萘乙酸可湿性粉剂中萘乙酸含量
UPLC-Q-TOF-MSE技术快速定性艾纳香抗菌有效部位的化学成分
龙脑樟去油枝叶中总多酚的酶解-超声辅助提取及抗氧化活性
艾纳香咀嚼片处方工艺的优化
GC法同时测定艾纳香油中3种成分
气相色谱法测定复方丹参滴丸给药制剂中异龙脑和龙脑含量
复硝酚钠与萘乙酸处理对红花羊蹄甲扦插效果的影响
“艾纳香加工工艺优化及产品研发”成果通过评价