新型聚BMA—co—TMPTMA整体柱的制备、表征

陈吓俤+游美玲+程锦添+童萍+张兰

摘要：试验运用原位聚合法，在引发剂诱发作用下聚合了疏水性单体甲基丙烯酸苄基酯（BMA）、带负电的2-丙烯酸酰胺2-甲基丙磺酸（AMPS）和交联能力强的交联剂三羟甲基丙烷三甲基丙烯酸酯（TMPTMA）。通过优化致孔剂比例和环己醇比例，结合电镜图观察，当致孔剂含量为70%时，整体柱不仅通透性好，而且不容易坍塌、剥落。当致孔剂中环己醇比例为55%时，整体柱背压最低，通透性最好，同时用毛细管电色谱（CEC）对该整体柱的表征为柱大、中、小孔都具备，且空隙均匀，柱效高，渗透性好，重现性和柱寿命良好。

关键词：毛细管电色谱;甲基丙烯酸苄基酯;疏水整体柱

中图分类号：O657          文献标识码：A          文章编号：0439-8114（2014）12-2882-04

The Preparation and Characterization of New Capillary Column based on

BMA-co-TMPTMA

CHEN Xia-di1，YOU Mei-ling1， CHENG Jin-tian2，TONG Ping2，ZHANG Lan2

（1. Wuyi University/Key Laboratory of Green Chemical Industry Technology of Fujian Province， Wuyishan 354300，Fujian，China;

2. Fuzhou University/Fujian Provincial Key Laboratory of Analysis and Detection Technology for Food Safety， Fuzhou 350002，China）

Abstract： A capillary electrochromatography monolithic column with hydrophobic stationary phases was prepared in situ polymerization of benzyl methacrylate， trimethylolpropane three methyl acrylate and 2-acrylic acid amides- 2-methyl propyl sulfonic acid in the presence of porogens. Through optimizing the ratio of porogens and the ratio of cyclohexanol in porogens， the column achieve good permeability with diverse holes when the percentage was 70%. The backpressure of monolithic column reached the lowest and the permeability was the best when the  percentage of cyclohexanol was 55%. Based on this column， repeatability， column life， electroosmotic flow and efficiency were characterized under CEC mode. The interspace was even， column efficiency high， the permeability good while the reproducibility was good and the column life was long.

Key words： capillary electrochromatography; benzyl methacrylate; hydrophobic monolithic column

毛细管电色谱（CEC）发展历史并不长，但是它所具备的电泳高效性与液相色谱的高选择性的特点，使CEC正在获得广泛的关注，并成为研究热点之一[1-3]。作为CEC的核心部分，整体柱具有制备容易、药品用量少、柱效高、选择性高、分离速度快等优点[4]。整体柱克服了开管柱柱容量低的缺陷，也无需柱塞，其中有机聚合物整体柱具有制备方法简单、柱上官能团容易引入的优点，因此，它在CEC 上的分离研究中展现出巨大的应用潜力[5-7]。

试验采用三元交联剂三羟甲基丙烷三甲基丙烯酸酯（TMPTMA），该交联剂含有三个双键，交联能力强，能形成刚性网络结构、稳定性强、孔比表面积大，疏水性较强，从而保证了整体柱的高柱效和高色谱分离能力[8]。单体主要采用甲基丙烯酸苄基酯（BMA），该单体具有官能团苄基，具有较强的疏水性[9]。另一个单体是-2-丙烯酸酰胺-2-甲基丙磺酸（AMPS），该单体含有负电的磺酸基团，能很好的为化合物的分离提供电渗流，加快物质的分离[10，11]。本试验优化了整体柱中致孔剂比例、环己醇在致孔剂中比例，制备聚BMA-co-TMPTMA整体柱，对整体柱的柱效、电渗流、渗透性、重现性、柱寿命进行表征，为新型聚合物整体柱的开发和利用提供一定的参考[12]。

1  材料与方法

1.1  试剂、材料及仪器

试剂：甲基丙烯酸苄基酯（BMA）、三羟甲基丙烷三甲基丙烯酸酯（TMPTMA）、环己醇、1，4-丁二醇、γ-甲基丙烯酸氧丙基三甲氧基硅烷（γ-MAPS）、2-丙烯酰胺-2-甲基-1-丙磺酸（AMPS）均购自Alfa Aesar公司;偶氮二异丁腈（AIBN）为化学纯，购自天津市福晨化学试剂厂;苯、甲苯、乙苯、戊苯、己苯、乙腈、甲醇为色谱纯，磷酸二氢钠、盐酸、氢氧化钠为分析纯，均购自国药集团化学试剂有限公司;所用水均为超纯水。endprint

材料：毛细管（100 μm ID×375 μm OD，河北永年光导纤维厂）。

仪器：HP3D型高效毛细管电泳仪、1100型高效液相色谱仪（美国Agilent公司）;GC-2010型岛津气相色谱仪（北京京科瑞达科技有限公司）;环境扫描电镜仪（飞利浦公司）;DK-8D型电热恒温水槽（上海一恒科技有限公司）;WH-3型漩涡混合仪（上海沪西分析仪器厂有限公司）;HGC-24A型氮气吹干仪（厦门精艺兴业科技有限公司）;PHS-3C型精密酸度计（上海大普仪器有限公司）。

1.2  方法

1.2.1  试剂、毛细管前处理  试剂处理：TMPTMA 经活性炭固相萃取柱过滤;偶氮二异丁腈（AIBN） 经重结晶处理;配制样品、流动相的甲醇与乙腈以及超纯水都经过重新过滤，超声15 min。毛细管内壁硅烷化处理： ① 1.0 mol/L NaOH溶液通 2 h;②超纯水洗涤0.5 h; ③ 0.1 mol/L 盐酸通1 h;④超纯水冲洗 0.5 h;⑤甲醇通 30 min;⑥80 ℃氮吹2 h;⑦取50% γ-MAPS的甲醇液1.2 mL用注射器推入毛细管中，橡胶塞封口，60 ℃水浴24 h;⑧甲醇冲洗30 min;⑨60 ℃氮吹3 h，橡胶塞封口。

1.2.2  溶液配制  标准溶液制备：分别称取适量的硫脲、苯、甲苯、乙苯、戊苯、己苯，用甲醇配制成1.0 mg/mL 的各样品储备液。试验前，取适量用甲醇稀释。所有溶液、试剂在进样分析前，用 0.22 μm 聚丙烯微孔滤膜过滤。缓冲液配制：配制 100 mmol/L NaH2PO4 母液备用。取适量母液于烧杯中，用0.1 mol/L HCl溶液或 1.0 mol/L NaOH 溶液调节至所需 pH。将调好 pH 的溶液倒入容量瓶中定容，并超声混匀 15 min。

1.2.3  聚 BMA-co-TMPTMA 整体柱固定相的制备  将混液（TMPTMA 60 μL，BMA 90 μL，AMPS 0.6 mg，AIBN 2.0 mg，环己醇192 μL，1，4-丁二醇128 μL，超纯水30 μL超声混匀15 min，氮吹脱氧15 min，立即将溶液注入处理过的毛细管中，注射长度25 cm，距尾端余10 cm。橡胶塞封口，60 ℃水浴24 h。将整体柱一端连在高压液相泵上，用甲醇除去致孔剂和未反应的单体等。在距柱床末端1 mm处，去除聚酰亚胺层作为检测窗口。

1.2.4  色谱条件  流动相：70%乙腈、pH 11.0、  10.0 mmol/L 磷酸盐缓冲液;分离电压：20 kV;电动进样：15 kV/3 s;检测波长：214 nm;整体柱：100 μm×25 cm（至检测器 8.5 cm，总长 33.5 cm）;柱温：25 ℃。

2  结果与分析

2.1  整体柱的性能评价

从毛细管的柱床部分切下一段长为3.3 mm的毛细管内部聚合物，用扫描电镜观察形貌，从图1 中可以看出，整体柱的孔径分布均匀，并且含有大孔、中孔、小孔。大孔使柱子的背压大大降低，分析物能够在短时间内快速分离，中孔和小孔使得柱子的固定相与分析物的接触面积增大，分析物通过不断地与柱床及流动相的色谱吸附洗脱作用，不仅色谱峰形尖锐，而且分辨率与分离度大大提高。

2.1.1  致孔剂中环己醇的比例优化  整体柱的孔隙分布主要由致孔剂种类及各致孔剂之间的比例决定。本试验采用环己醇、1，4-丁二醇和超纯水组成三元致孔体系。超纯水在致孔剂中的比例保持 9%，致孔剂总量在聚合物混合溶液中的比例保持 60%。试验优化了致孔剂中环己醇的比例，各整体柱的致孔剂配比详见表1。由表1可知，C1～C4、C8 柱中，整体柱背压很高，通透性差;C5～C7 柱中柱压适中。当环己醇在致孔剂总量中所占比例大于55% 时，柱子的通透性随环己醇比例的增加而变差;当环己醇在致孔剂总量中所占比例小于 55% 时，整体柱背压随着环己醇比例的增大而降低。环己醇的含量影响到整体柱孔隙的大小，当环己醇比例在 55% 时，整体柱背压最低，通透性最好。因此，最后选择55%的环己醇为最优比例。

2.1.2  致孔剂含量的确定  整体柱的通透性基本取决于致孔剂的含量。不同致孔剂含量制得的整体柱电镜图见图2。当致孔剂含量为80%时，整体柱柱床容易坍塌;当致孔剂含量为70%时，整体柱不仅通透性好，而且不容易坍塌、剥落;当致孔剂含量为 60%时，孔隙减少，背压增大，不适合作色谱柱;当致孔剂含量为50%时，整体柱结构过于致密，孔隙太少，无法进行色谱试验。为保证色谱分离能力和良好通透性，最终致孔剂含量定为70%。

2.2  毛细管整体柱的电色谱性能表征

2.2.1  柱效  用烷基苯进行电色谱试验来考察柱子的色谱性能，整体柱性能优良，苯、甲苯、乙苯、戊苯、己苯理论塔板数分别为 91 760 、90 288 、86 436、85 868 、86 160 plates/m。

2.2.2  电渗流  乙腈相对水而言，它在流动相中的添加，会使电渗流减少。为了能让流动相的电渗流发生改变，优化分离条件，本试验采用乙腈作为有机改性剂。由图3 可知，当乙腈体积分数从 40% 增加到 80% 时，流动相线速度呈递增趋势。当乙腈体积分数低于 40% 时，流动相线速度随乙腈体积分数的减少而增加。乙腈体积分数较低时，流动相中离子强度起主导作用，因此随着乙腈体积分数的递减，电渗流速度反而增大。

2.2.3  渗透性  在液相泵上对整体柱进行渗透性测试，当甲醇流速为1 μL/min 时，柱压为12.7 MPa。将该整体柱放在电泳仪上测试，流动相：pH 7.0，10.0 mmol/L 含 70 %乙腈的磷酸盐缓冲溶液，分离电压：15 kV，两端加1.1 MPa气压，硫脲约4.25 min 出峰。这些都说明所制得的整体柱具有良好的渗透性，该整体柱孔径均匀，含大孔结构，因此背压低，渗透性良好。endprint

2.2.4  重现性  采用5种甲醇配制的烷基苯（苯、甲苯、乙苯、戊苯、己苯），对其进行连续3次进样，观察其重现性效果（图4）。5种烷基苯出峰顺序完全按照其疏水性强弱的顺序，依次是苯、甲苯、乙苯、戊苯、己苯。3次进样结果显示，保留时间的RSD小于0.31%，峰面积的RSD小于2.8%，说明该配方整体柱重现性良好。

2.2.5  柱寿命  在弱酸、弱碱以及中性流动相环境下，该整体柱可以正常使用两个月，柱效及重现性良好，未有明显变化。在pH 11.0的强碱性条件下，该整体柱可以正常使用3周左右。聚甲基丙烯酸酯类整体柱能够在较宽的pH范围内保持良好的稳定性，但是过强的酸碱容易造成整体柱柱床的腐蚀、坍塌。

3  结论

本试验采用甲基丙烯酸苄基酯为功能单体，三羟甲基丙烷三甲基丙烯酸酯为交联剂，环己醇、1， 4-丁二醇、超纯水为三元致孔体系，运用自由基聚合法制备了一种新型毛细管电色谱整体柱。该柱大、中、小孔都具备，且空隙均匀，柱效高，渗透性好，重现性和柱寿命良好。5种烷基苯的基线分离，证实了该柱较强的疏水性，为整体柱的进一步开发和利用奠定了基础。

参考文献：

[1] GUO Y， COLON L A. A stationary phase for open tubular liquid chromatography and electrochromatography using sol-gel technology[J].Analytical Chemistry， 1995，67（15）： 2511-2516.

[2] GUERROUACHE M， CARBONNIER B， VIDAL-MADJAR C， et al. In situ functionalization of N-acryloxysuccinimide-based monolith for reversed-phase electrochromatography[J]. Journal of Chromatography A，2007，1149（2）：368-376.

[3] CARBONNIER B， GUERROUACHE M， DENOYEL R， et al. CEC separation of aromatic compounds and proteins on hexylamine-functionalized N-acryloxysuccinimide monoliths[J]. Journal of Separation Science， 2007， 30（17）： 3000-3010.

[4] LI Y， GU B， LEE M L， et al. Reparation of polymeric monoliths by copolymerization of acrylatemonomers with amine functionalities for anion-exchange capillary liquid chromatography of proteins[J]. Journal of Chromatography A， 2009， 1216（29）：5525-5532.

[5] 王婷婷，梁  振，张丽华，等.聚十二烷基甲基丙烯酸酯整体柱的制备及其在毛细管电色谱法分离肌红蛋白酶解产物中的应用 [J].色谱， 2010，28（3）：236-239.

[6] PING G C， ZHANG W B， ZHANG L H， et al. Rapid separation of nucleosides by capillary electrochromatography with a methacrylate-based monolithic stationary phase[J]. Chromatograp

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[10] CAI J B， LIU B Z， LIN P， et al. Fast analysis of nicotine related alkaloids in tobacco and cigarette smoke by megabore capillary gas chromatography[J]. Journal of Chromatography A， 2003， 1017（1-2）： 187-193.

[11] STURM S， SCHINNERL J， GREGER H， et al. Nonaqueous capillary electrophoresis-electrospray ionization-ion trap-mass spectrometry analysis of pyrrolo-and pyrido[1，2-a]azepine alkaloids in Stemona[J]. Electrophoresis，2008，29（10）：2079-2087.

[12] 林志銮，陈培珍，王艳萍，等.桂花叶多糖提取工艺的优化[J]. 湖北农业科学， 2012，51（5）：986-988.endprint

2.2.4  重现性  采用5种甲醇配制的烷基苯（苯、甲苯、乙苯、戊苯、己苯），对其进行连续3次进样，观察其重现性效果（图4）。5种烷基苯出峰顺序完全按照其疏水性强弱的顺序，依次是苯、甲苯、乙苯、戊苯、己苯。3次进样结果显示，保留时间的RSD小于0.31%，峰面积的RSD小于2.8%，说明该配方整体柱重现性良好。

2.2.5  柱寿命  在弱酸、弱碱以及中性流动相环境下，该整体柱可以正常使用两个月，柱效及重现性良好，未有明显变化。在pH 11.0的强碱性条件下，该整体柱可以正常使用3周左右。聚甲基丙烯酸酯类整体柱能够在较宽的pH范围内保持良好的稳定性，但是过强的酸碱容易造成整体柱柱床的腐蚀、坍塌。

3  结论

本试验采用甲基丙烯酸苄基酯为功能单体，三羟甲基丙烷三甲基丙烯酸酯为交联剂，环己醇、1， 4-丁二醇、超纯水为三元致孔体系，运用自由基聚合法制备了一种新型毛细管电色谱整体柱。该柱大、中、小孔都具备，且空隙均匀，柱效高，渗透性好，重现性和柱寿命良好。5种烷基苯的基线分离，证实了该柱较强的疏水性，为整体柱的进一步开发和利用奠定了基础。

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2.2.4  重现性  采用5种甲醇配制的烷基苯（苯、甲苯、乙苯、戊苯、己苯），对其进行连续3次进样，观察其重现性效果（图4）。5种烷基苯出峰顺序完全按照其疏水性强弱的顺序，依次是苯、甲苯、乙苯、戊苯、己苯。3次进样结果显示，保留时间的RSD小于0.31%，峰面积的RSD小于2.8%，说明该配方整体柱重现性良好。

2.2.5  柱寿命  在弱酸、弱碱以及中性流动相环境下，该整体柱可以正常使用两个月，柱效及重现性良好，未有明显变化。在pH 11.0的强碱性条件下，该整体柱可以正常使用3周左右。聚甲基丙烯酸酯类整体柱能够在较宽的pH范围内保持良好的稳定性，但是过强的酸碱容易造成整体柱柱床的腐蚀、坍塌。

3  结论

本试验采用甲基丙烯酸苄基酯为功能单体，三羟甲基丙烷三甲基丙烯酸酯为交联剂，环己醇、1， 4-丁二醇、超纯水为三元致孔体系，运用自由基聚合法制备了一种新型毛细管电色谱整体柱。该柱大、中、小孔都具备，且空隙均匀，柱效高，渗透性好，重现性和柱寿命良好。5种烷基苯的基线分离，证实了该柱较强的疏水性，为整体柱的进一步开发和利用奠定了基础。

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