高效液相色谱法测定延胡索药材中7 种异喹啉类生物碱的含量

赵新娟，沈 梅，石俊敏，韩伟立*

1山西省晋中市第一人民医院药剂科，晋中 030600;2 南方医科大学公共卫生与热带医学学院 卫生检测中心，广州 510515;3 华南师范大学药物研究院，广州 510632

延胡索为罂粟科紫堇属植物延胡索(Corydalis yanhusuoW.T.Wang)的干燥块茎，其具有活血、利气和止痛的功效。临床上主要用于治疗胸胁、脘腹疼痛、经闭痛经、产后瘀阻和跌打肿痛等症［1］。在2010年版《中国药典》中，接近30%的复方制剂中使用了延胡索［2］。建立全面有效的延胡索药材质量评价方法，直接关系到延胡索相关药品及临床处方使用安全及疗效。

现代药理研究表明，延胡索中主要活性成分为异喹啉类生物碱，目前延胡索的质量控制多以异喹啉类生物碱四氢巴马汀作为主要指标，具体方法包括化学发光法、紫外分光光度法、高效液相色谱法及质谱法等［3-6］。然而，延胡索中除四氢巴马汀外，其它异喹啉类生物碱也具有显著的生理活性且含量较大，如小檗碱具有抗肿瘤作用［7］，四氢黄连碱具有抗焦虑作用［8］等。显然用单一成分(四氢巴马汀)很难全面控制延胡索药材的内在质量。延胡索多组分质量控制在国内亦有相关报道，其中周卿［9］等对延胡索中四种生物碱，高建莉［10］等对延胡索中五种生物碱的含量进行了多组分质量控制研究的尝试，而针对更多活性组分的质量控制研究，在国内文献上报道相对较少。因此，本课题组在前期对延胡索化学成分研究的基础上［11］，利用高效液相色谱法对延胡索药材中含量较大的7 种异喹啉生物碱类成分(巴马汀、小檗碱、去氢紫堇碱、四氢巴马汀、异紫堇球碱、紫堇碱及四氢黄连碱)进行了定性及定量分析，并分别考察了不同购买地延胡索药材中7 种生物碱的含量，以期为延胡索原药材较为合理的质量控制提供科学依据。

1 仪器与材料

Waters 高效液相色谱仪(Waters Corp.，USA)，包括2695 型分离色谱系统和2996 型光电二极管矩阵检测器。加热回流装置BUCHI Syncore 系统(BUCHI Corp.，German)。所用乙腈、冰醋酸和三乙胺均为色谱纯(Merck Corp.，USA)，水为超纯去离子水(Millipore Corp.，USA)。巴马汀、小檗碱、去氢紫堇碱、四氢巴马汀、异紫堇球碱、紫堇碱和四氢黄连碱对照品均为自制［11］，纯度均高于96%。市售延胡索药材分别购于浙江、安徽、陕西及广东，由山西中医学院中药鉴定室王兵鉴定为延胡索(Corydalis yanhusuoW.T.Wang)的干燥块茎。

2 方法与结果

2.1 样品溶液的制备

取0.5 g 干燥延胡索药材粉末(过60 目筛)，精密称定，加入浓氨试液-甲醇(1 ∶20)混合溶液50 mL，称定重量，冷浸1 h 后加热回流1 h，放冷，再称定重量，用浓氨试液-甲醇(1∶20)混合溶液补足减失的重量，摇匀，滤过，精密吸取续滤液25 mL，旋转蒸发仪回收溶剂，残渣加甲醇溶解，定容至5 mL。用0.45 μm 滤膜过滤，取续滤液备用。

2.2 标准品溶液的制备

分别精密称取巴马汀、小檗碱、去氢紫堇碱、四氢巴马汀、异紫堇球碱、紫堇碱和四氢黄连碱标准品4.01、3.95、10.13、9.98、4.12、10.01 和3.97 mg，置于10 mL 容量瓶中，加甲醇溶解并定容，摇匀，即得浓度为0.401 mg/mL 的巴马汀，0.395 mg/mL 的小檗碱、1.013 mg/mL 的去氢紫堇碱、0.998 mg/mL 的四氢巴马汀、0.412 mg/mL 的异紫堇球碱、1.001 mg/mL 的紫堇碱和0.397 mg/mL 的四氢黄连碱混合对照品储备溶液。

2.3 液相色谱条件

色谱柱:Agilent SB C18柱(4.6 × 250 mm，5(m);保护柱:Agilent SB C18柱(4.6 ×12.5 mm，5(m);流动相:乙腈(A)，0.1%的醋酸水溶液(三乙胺调pH 至5.0)(B)，采用梯度洗脱方式:0～18 min，30% A;18～35 min，30%～80% A;35～40 min，80% A;40～42 min，80%～30% A;42～45 min，30% A。流速为1.0 mL/min，检测波长为280 nm，进样量10 μL，柱温30 ℃。药材样品中各定量成分与标准品生物碱成分色谱峰保留时间一致，紫外谱图一致。色谱图见图1。

图1 混合对照品(A)和延胡索样品(B)的HPLC 色谱图Fig.1 HPLC chromatograms of mix standard (A)and C.yanhusuo sample (B)

2.4 线性关系考察

吸取“2.2”项中混合对照品储备溶液，甲醇分别稀释10、20、40、80、100、200 倍，按照2.3 项下色谱条件进行分析，以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，进行回归分析，结果见表1。

表1 7 个异喹啉生物碱的线性方程Table 1 Calibration curve and linear ranges of the 7 investigated isoquinoline alkaloids

2.5 精密度试验

2.5.1 日内精密度试验

取混合对照品溶液，按样品测定项下色谱条件进行HPLC 分析，重复进样6 次，结果显示巴马汀、小檗碱、去氢紫堇碱、四氢巴马汀、异紫堇球碱、紫堇碱和四氢黄连碱峰面积的RSD 分别为0.29%、0.17%、0.24%、0.24%、0.70%、0.45%和0.17%。

2.5.2 日间精密度试验

取混合对照品溶液，连续3 日，每日连续进样2针，测定结果显示巴马汀、小檗碱、去氢紫堇碱、四氢巴马汀、异紫堇球碱、紫堇碱和四氢黄连碱峰面积的RSD 分 别 为0.45%、0.29%、0.37%、0.27%、1.83%、0.33%和0.28%。以上结果表明色谱系统稳定，仪器精密度良好。

2.6 重复性实验

精密称取6 份相同的延胡索样品粉末，按照样品测定项下方法进行测定，得到相应的峰面积并计算含量，结果显示巴马汀、小檗碱、去氢紫堇碱、四氢巴马汀、异紫堇球碱、紫堇碱和四氢黄连碱成分含量的RSD 分别为3.41%、3.51%、3.59%、2.88%、3.75%、1.60%和3.48%，结果表明该方法重现性好。

2.7 稳定性实验

取混合对照品溶液，进样量为10 (L，分别于0、2、4、6、8、10 h 在样品测定项下方法进行测定，计算峰面积RSD，结果显示巴马汀、小檗碱、去氢紫堇碱、四氢巴马汀、异紫堇球碱、紫堇碱和四氢黄连碱样品峰面积RSD 分别为0.23%、0.14%、0.18%、0.34%、0.56%、0.59%和0.26%。表明试样溶液在10 h 内具有良好的稳定性。

2.8 加样回收率实验

精密称取0.50 g 的9 份已知含量的延胡索药材粉末，加入低、中、高3 个浓度的混合标准品溶液(其中中浓度相当于7 种待测生物碱在药材中的实际含量)，具体数据见表1，按“2.1”项中方法制备供试品溶液，再按“2.3”相中色谱条件进样测定，计算含量及加样回收率结果见表2。

表2 加样回收率(n=3)Table 2 Results of recovery tests (n=3)

2.9 样品测定

取不同来源［安徽合肥(A)、浙江杭州(B)、陕西宝鸡(C)、广东珠海(D)］延胡索药材制备定量供试品溶液，按标准曲线外标法计算供试品中各生物碱含量，结果见表3。

表3 不同购买地延胡索中7 种异喹啉生物碱的含量Table 3 Determination 7 isoquinoline alkaloids in C.yanhusuo from different purchase places

3 讨论与结果

本文在优化流动相过程中，考察了甲醇-水和乙腈-水系统，分别加入醋酸、醋酸铵、醋酸和三乙胺等;同时还对不同pH 值(pH 4.5、5 和6)及不同醋酸浓度(0.1%和0.2%)的分离效果进行了测试。其中乙腈-0.1% 的醋酸水溶液(三乙胺调pH 至5.0)系统效果最好，此外，等度洗脱不能达到7 种异喹啉生物碱的基线分离，故采用了梯度洗脱。从色谱图看，各个色谱峰均能得到很好的分离。

本文利用建立的分析方法对不同购买地市场延胡索药材中巴马汀、小檗碱、去氢紫堇碱、四氢巴马汀、异紫堇球碱、紫堇碱及四氢黄连碱的含量进行了测定。实验结果显示，《中国药典》2010 版中延胡索含量测定的指标化合物四氢巴马汀所占药材生物碱含量在不同购买药材中并非含量最高(去氢紫堇碱及紫堇碱含量较四氢巴马汀高)，此外不同市场药材中7 种异喹啉生物碱的含量存在较大的差异。因此单一使用四氢巴马汀作为延胡索的质量控制指标是不妥的，建议对延胡索药材采用多指标质量控制。

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