速熟腐乳生产中腐乳成分及微观结构的分析

汪建明，张 燕，于水淼，贺 乐，李立英

(食品营养与安全教育部重点实验室，天津科技大学食品工程与生物技术学院，天津 300457)

腐乳作为大豆的一种发酵制品，富含蛋白质以及亚油酸、油酸等不饱和脂肪酸，不含胆固醇等[1].发酵成熟的腐乳具有营养较丰富、质构较细腻柔滑、滋味鲜美和诱人食欲的特点，是人们喜爱的开胃佐餐食品和调味品.在欧美，腐乳因其质构类似软质干酪而被称为“Chinese-cheese”[2].

传统腐乳的后酵过程是形成其特殊质地和风味的关键，但是后期成熟周期较长，一般情况下要经过4～6 个月，腐乳的色、香、味才能达到品质要求，使得工厂的生产效率偏低，经济成本偏高.因此，在添加一定酶制剂促进蛋白质和脂肪酶解的基础上，采用添加乳酸菌混合菌种发酵剂发酵、产酸实现凝乳，从而得到的速熟腐乳，既可以改善传统腐乳产品发酵周期长的问题，同时可提高生产效率.

腐乳的质量评价通常是通过感官评定来确定，但是感官评定的重现性不佳，所以不能作为唯一的评价指标.氨基态氮含量和蛋白质水解度可以作为评价腐乳成熟程度的指标之一，二者呈正相关性.聚丙烯酰胺-凝胶电泳(SDS-PAGE)是分离腐乳蛋白成分并确定其相对分子质量的有效方法，这种方法基于蛋白质或肽的物理性质进行分离[3-5].腐乳质构主要指腐乳内在的性质，如弹性、黏性、硬度、脆性.此外，水分含量也影响腐乳的质地.利用扫描电镜可以对腐乳进行微观结构观察.

本文研究了利用乳酸菌混合发酵剂生产速熟腐乳在成熟过程中的理化指标、感官品质、蛋白质水解度、质构特性以及微观结构变化，并与市售腐乳进行对比.

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 原料

大豆，市售；MT-53X(乳酸菌、乳脂乳球菌、嗜热链球菌)发酵剂、Accelerzyme CPG、Piccantase A，荷兰DSM 公司；利民市售腐乳，天津市利民调料有限公司；王致和市售腐乳，北京王致和食品集团有限公司.

1.1.2 主要试剂

甲醛，中国医药上海化学试剂公司；硝酸银，上海化学试剂厂；铬酸钾，北京化学试剂公司；丙烯酰胺，北京鼎国昌盛生物技术有限公司；N，N-亚甲基双丙烯酰胺、三羟甲基氨基甲烷，北京化工厂；过硫酸铵，天津市北方天医化学试剂厂；β-巯基乙醇、考马斯亮蓝R-250，Amresco 化学试剂公司；甘氨酸，天津市化学试剂一厂；十二烷基磺酸钠(SDS)、四甲基乙二胺(TEMED)，加拿大BBI 公司.

1.1.3 主要设备

FE-20 型pH 计、AB204-N 型电子分析天平，梅特勒托利多仪器有限公司；SU1510 型扫描电镜，日本电子株式会社(JEOL)；JY-SP-BT 型电泳槽、JY-600 型电泳仪，北京六一电泳设备有限公司；高速台式冷冻离心机、冷冻干燥机，Thermo 电子公司；台式恒温振荡培养箱，北京沃德创意技贸有限责任公司；HWS260 型电热恒温水浴锅，上海一恒科学仪器有限公司；TA-XT 质构仪，英国Stable Micro Systems公司.

1.2 实验方法

1.2.1 工艺流程

速熟腐乳的制作流程如图1 所示.

图1 速熟腐乳的制作流程图Fig.1 Flow chart of making instant-sufu

1.2.2 样品的制备[6-7]

豆浆：大豆500,g，液料比(mL∶g)为1∶3，24.5,℃浸泡9,h，磨浆水温61,℃.

白坯：豆浆(固形物含量8%)，酶制剂(m(CPG)∶m(A)＝2∶1)添加量为1.5,mg/L，发酵剂的添加量为0.2,mL/L，培养温度为30,℃，培养时间为6,h，氯化钙的添加量为0.2,g/L，将白坯切成3.0,cm×3.0,cm×3.0,cm 的豆腐块备用.

毛坯：在制成的白坯豆腐块上喷洒毛霉孢子，在28,℃电热恒温培养箱中培养40,h.

腐乳：将经酶解的毛坯在75～80,℃条件下保持30,min，再将经灭酶的毛坯放在汤料中，进行后酵贮藏.

1.2.3 腐乳的感官评定

按照DB,52/525—2007[8]，评分标准与细则见表1.

表1 腐乳的感官评分标准Tab.1 Sensory evaluation rules of sufu

1.2.4 测量方法

水分含量的测定采用直接干燥法[9].

总酸含量(乳酸)的测定采用酸碱中和滴定(酸度计)法[10].

氨基酸态氮含量的测定采用甲醛滴定法[11-12].

蛋白质含量的测定采用凯氏微量定氮法[13].

NaCl 含量的测定采用硝酸银滴定法[14]，并稍作改进：精确称取10,g 样品，加入90,mL 蒸馏水搅拌均匀，在电炉上烧开后冷却，定容至100,mL.精确吸取5,mL，随后加入25,mL 蒸馏水，加入10 滴铬酸钾指示剂，用0.1,mol/L 硝酸银滴至砖红色为终点，记录消耗硝酸银标准溶液的体积.同时进行试剂空白实验，计录空白滴定消耗硝酸银标准溶液的体积.NaCl含量的计算公式为

式中：V 为消耗硝酸银标准溶液的体积，mL；V0为空白滴定时，消耗硝酸银标准溶液的体积，mL；c 为硝酸银标准溶液的浓度，mol/L；NaCl 的摩尔质量为0.058 44,kg/mol；m 为样品的质量，g.

1.2.5 SDS-PAGE 电泳的测定

A 液(丙烯酰胺储存液)：称取29.2,g 丙烯酰胺和0.8,g 双丙烯酰胺，加蒸馏水至100,mL，4,℃冰箱保存.

B 液(4#分离胶缓冲液)：将75,mL 2,mol/L 的Tris-HCl(pH 8.8)、4,mL 10% SDS、21,mL 蒸馏水混匀，4,℃冰箱保存.

C 液(4#浓缩胶缓冲液)：将50,mL 1,mol/L 的Tris-HCl(pH 6.8)、4,mL 10% SDS、46,mL 蒸馏水混匀，4,℃冰箱保存.

电泳缓冲液：称取3,g Tris、14.4,g 甘氨酸、1,g SDS，加蒸馏水至1,L.

上样缓冲液：含有 2,mL 0.5,mol/L Tris-HCl(pH,6.8)，2,mL 甘油，2,mL 10% SDS，0.5,mL 0.1%溴酚蓝，1.0,mL 2-β-巯基乙醇，2.5,mL 双蒸水，室温保存.

分离胶的配制(15%，20,mL)：10,mL A 液，5,mL B 液，0.1,mL 10%过硫酸铵，10,µL TEMED，0.5,mL蒸馏水，混匀，现用现配.

浓缩胶的配制(5%，8,mL)：1.34,mL A 液，2,mL C 液，60,µL 10%过硫酸铵，10,µL TEMED，4.6,mL 蒸馏水，混匀，现用现配.

染色液：0.2,g 考马斯亮蓝R-250，84,mL 95%乙醇，20,mL 冰乙酸，定容到200,mL 并过滤，室温保存.

脱色液：乙醇、冰乙酸、蒸馏水的体积比为9∶1∶10.

取0.05,g 样品，加入100,µL 去离子水，室温振荡2,h，10,000,r/min 离心5,min，取上清液备用.取上清液加入上样缓冲液，煮沸5,min，8,000,r/min 离心5,min.用微量进样器将处理好的样品缓慢均匀加入加样孔中.浓缩胶上所加的电压是80,V，当染料进入分离胶后，将电压提高至120,V.电泳结束后，凝胶在固定液中固定1,h，染色5,h 后脱色，直到蛋白质背景干净，蓝色条带清晰为止.最后用凝胶成像仪进行数据采集并分析[15].

1.2.6 质构分析

质构分析是采用压缩方式测试食品的触觉特性.触觉特性影响到消费者的感官感觉和对食品的接受程度[16].选取探头类型为P/0.5，测前速度为3.00,mm/s，测中速度为 1.50,mm/s，测后速度为1.50,mm/s，2 次下压间隔时间为10.00,s，下压距离为10.00,mm.

测定的质构参数包括硬度、弹性、内聚性、黏性、咀嚼度和回复性，各参数的定义见表2[17].

表2 质构参数的含义Tab.2 Definition of texture parameters

1.2.7 微观结构观测

取待测样品切成薄片，使其表面保持平整，浸泡于2.5%的戊二醛溶液中，置在4,℃条件下固定3,h 以上.然后，用pH,7.2 的磷酸缓冲液清洗3 次，每次保持10,min.分别用30%、50%、70%、90%、100%的乙醇梯度脱水10,min 左右.再将样品放置在冷冻干燥器下迅速冷冻，然后进行捶击，使之自然断裂，选择小块样品.采用离子溅射方法喷金约5,min，最后置于扫描电镜下进行观察[18-19].

2 结果与讨论

2.1 感官品质评价

对速熟腐乳进行感官指标的测定，并与市售的利民腐乳和王致和腐乳进行对比，结果见表3.

表3 速熟腐乳与传统腐乳的感官评价分析比较Tab.3 Sensory evaluation of instant-sufu and traditional sufu

由表3 可以看出：速熟腐乳在色泽、口感和香气等方面与市售的腐乳没有显著差异.

2.2 理化指标分析

将发酵30,d 的速熟腐乳与市售的利民腐乳和王致和腐乳进行比较，3种腐乳的理化指标对比结果见表4.

由表4 可以看出：速熟腐乳的水分含量、总酸含量、氨基酸态氮和蛋白质含量与市售的利民腐乳和王致和腐乳没有显著的差异，均符合国家标准；速熟腐乳的NaCl 含量明显低于市售的两种腐乳，且略低于国家标准，这更加符合人们对低盐食品的需求，同时也改变了腐乳只能作为调料品的观念，其可作为辅餐食用.

表4 速熟腐乳与传统腐乳的理化指标比较Tab.4 Index comparison of instant-sufu and traditional sufu

2.3 SDS-PAGE电泳分析

分别取白坯、毛坯、后酵10,d，后酵20,d、速熟腐乳(后酵30,d)、利民腐乳、王致和腐乳进行电泳实验，并采用凝胶呈像系统软件，通过相对分子质量的对比分析乳酸菌发酵豆乳凝胶样品中蛋白质的水解情况，结果见图2.

图2 样品的SDS凝胶电泳图Fig.2 SDS-PAGE of the sample

由图2 可以看出：白坯中大豆蛋白主要由7,S 和11,S 球蛋白构成，7,S 主要由α′、α、β 三个亚基构成，相对分子质量分别为76,000、72,000、50,000，而11,S由酸性亚基(相对分子质量为 30,000～40,000)和碱性亚基(相对分子质量在25,000 以下)构成.在乳酸菌发酵豆乳凝胶过程中，随着发酵时间的延长，大分子质量的蛋白质被水解成小分子质量的胨、肽和氨基酸，球蛋白的水解程度也增加，7,S 和11,S 球蛋白的亚基被水解，表现为条带变窄，说明出现了大量的小分子质量物质.在11,S 碱性亚基以下的小分子的快速迁移中肽随时间逐渐增多，最终该新型的速熟腐乳后酵30,d 所得到的腐乳与市售成熟6 月的腐乳出现条带的宽窄相似，表明速熟腐乳的成熟程度与市售腐乳一致.

2.4 质构分析

利用质构仪对白坯、发酵10,d、发酵20,d 和速熟腐乳(后酵30,d)样品进行质构参数测定，并与利民腐乳和王致和腐乳进行对比，结果见表5.

由表5 可以看出：速熟腐乳的硬度随着发酵的延长不断地变小，与市售的利民腐乳相差不大，但却明显高于市售王致和腐乳，这可能是因为在王致和腐乳在制作过程中水分含量较高；速熟腐乳的弹性、黏性、咀嚼度和回复性随着发酵时间的推后，均呈现小幅度下降的趋势，且与市售腐乳的指标相差不大，比较适中.

表5 样品的质构参数测量结果比较Tab.5 Comparison of texture and structure

2.5 微观结构观测

对白坯、速熟腐乳(后酵30,d)及市售的腐乳的微观结构进行电镜扫描实验，对比其微观结构，结果见图3.

图3 样品的微观结构对比Fig.3 Comparison of the microstructure of the samples

豆浆中由于水化膜和双电层的存在，使得蛋白质粒子均匀稳定地溶解于水中，而豆腐白坯则是借助乳酸菌产酸和钙桥的作用使得大豆蛋白相互联结，形成致密稳定的网络结构，如图3(a)所示.由于毛坯的水解作用，腐乳内部大的胶粒状蛋白质聚集体被降解成小聚集体，随着后酵时间的增加，蛋白质胶粒逐渐变小，当速熟腐乳的后酵时间达到30,d 时，坯体中胶粒蛋白质消失，蛋白质已经完全被水解，形成平滑均一的形态，如图3(b)所示.速熟腐乳与市售腐乳对比发现，速熟腐乳的微观结构与市售6 月的腐乳结构较相似，其形态较市售腐乳平滑均一，说明后酵30,d 的腐乳已达到成熟.

3 结语

本文将经乳酸菌混合发酵剂发酵得到的速熟腐乳与市售两种腐乳进行了对比.分析表明，在感官指标、电泳分析、质构分析、微观结构和理化指标中除NaCl 含量外，速熟腐乳与市售的利民腐乳和王致和腐乳间无明显差异，且符合国家标准.速熟腐乳的发酵生产周期显著缩短，并且其NaCl 含量明显低于市售腐乳，可作为辅餐使用，具有较好的开发前景.

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