高效液相色谱法检测红枣中苯甲酸

郑晓冬 宋烨 潘少香 孟晓萌 刘雪梅 闫新焕

（中华全国供销合作总社济南果品研究院，山东济南250014）

高效液相色谱法检测红枣中苯甲酸

郑晓冬 宋烨 潘少香 孟晓萌 刘雪梅 闫新焕

（中华全国供销合作总社济南果品研究院，山东济南250014）

本文建立了一种水溶液直接浸提结合高效液相色谱法检测红枣中苯甲酸的方法。采用剪切-均质-超声相结合的方式提取红枣中的苯甲酸，比较选择了液相色谱流动相类型与配比，检测了红枣样品中苯甲酸的含量，并进行了加标回收实验。结果显示，以甲醇:水（含0.15%乙酸铵）=5:95时，苯甲酸出峰锋型最佳，保留时间合适，分析速度快。该方法对苯甲酸的提取效率高，回收率在78.8%～105%之间，精密度在4.87%～5.42%之间。方法线性良好（2=0.9990），灵敏度高，测定下限为1.5mg/kg，可满足红枣中苯甲酸的检测需求。

红枣；苯甲酸；高效液相色谱

苯甲酸是一种使用较为广泛的食品添加剂，常用于食品防腐、延长货架期。但过量食用可诱发癌症，长期使用可诱发哮喘、荨麻疹及血管性水肿等变态反应，对人体健康造成不利影响[1-3]。国家标准对于苯甲酸在食品中的添加有严格限制，而且在部分食品中禁止使用。《食品添加剂使用卫生标准》（GB2760）中规定，红枣中不能含有苯甲酸。然而，在红枣的实际生产加工中往往能检测出苯甲酸，该问题长期以来一直困扰着红枣加工企业及广大消费者。

红枣中苯甲酸的来源（外来添加还是自然生成）则是该问题的焦点。国内外学者曾报道过其他水果、蔬菜、坚果中自然存在苯甲酸[4-6]，如成熟的红莓、青梅、李等约含0.05%的苯甲酸。Sibee等对某些食品中检出的苯甲酸结果如下：土豆、蚕豆0.2mg/kg；水果0～14mg/kg；坚果、黄豆1.2～11mg/kg[7,8]；Hbarnore也曾报道过苹果在被真菌感染后也会自然产生苯甲酸。由于果蔬中天然生成的苯甲酸含量较低，为了探究天然苯甲酸含量，则需要建立一种检出限更低，准确性更高的检测方法。

目前，食品中苯甲酸的检测通常依据国家标准《食品中山梨酸苯甲酸的测定》（GB/T 5009.29-2003）进行，也有大量文献报道了各类食品中苯甲酸液相色谱检测方法[9-13]。然而，未有高效液相色谱法检测红枣中苯甲酸的相关报道。红枣作为一种特殊的核果类果品，含有多种营养物质，最为显著的是多糖占到51.4%～66.5%[14,15]。这就导致其果肉粘性大，前处理困难。单纯采用国标方法来检测分析并不十分适用。本文针对高含糖量红枣样品，采用剪切-均质-超声相结合的提取方式，优化了高效液相色谱法检测红枣中的苯甲酸的条件与参数。同时，对市场中几种红枣产品中的苯甲酸进行了分析调研。旨在为红枣中苯甲酸的检测提供一种快速、可靠、准确的方法，积累一些不同红枣品种中苯甲酸含量及分布特点等基础信息。

1 材料与仪器

1.1 材料与试剂

灰枣1，产自新疆若羌县，乐陵市赛福佳枣业有限公司；

灰枣2，产自新疆，济南万福乐食品有限公司；

骏枣1，产自新疆和田，好想你枣业股份有限公司；

骏枣2，产自新疆，新疆本草堂中药饮片有限公司。

甲醇，色谱纯；乙酸铵，色谱纯；苯甲酸标准溶液（国家标准物质中心）；其他试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

高效液相色谱仪，岛津LC-10AT，配紫外检测器和色谱工作站；

高速离心机，德国Labofuge A；

均质机，德国T18basic；

超纯水仪，明澈D24 UV，0.45μm水膜过滤头。

1.3 方法

1.3.1 样品的提取

用剪刀将红枣果肉剪碎至直径为0.2～0.5cm大小的颗粒，准确称量5.00g，加蒸馏水混合，经均质机均质到无明显颗粒，然后超声处理5min，再用氢氧化钠溶液将pH值调为弱碱性，准确定容到50mL。取上层清液经0.45μm水膜过滤，得到样品提取液，待测[16]。

1.3.2 色谱条件

色谱柱：C18（250mm×4.6mm，5μm）；

流动相：甲醇:水（含0.15%乙酸铵）=5:95；

洗脱模式：等度洗脱；

洗脱速率：1.0mL/min；

检测器：紫外检测器，波长为230nm；

进样量：20μL。

2 结果与讨论

2.1 流动相及流速

通过优化对比流动相中有机相比例、水相溶液中乙酸铵的含量及流速，确定了最佳的色谱实验条件甲醇∶水（含0.15%乙酸铵）=5∶95，流速为1.0mL/min。在此条件下苯甲酸标准溶液出峰时间快，峰型好（见图1）。图2为实际红枣样品中苯甲酸色谱图，出峰时间较为适宜，且未收到红枣提取液中其他组分的干扰。

图1 苯甲酸标准溶液色谱图（浓度为20mg/L）Fig.1 The chromatograms of benzoic acid standard solution (concentration 20mg/L)

图2 新疆灰枣中苯甲酸检测色谱图Fig.2 The chromatograms of benzoic acid in Xinjiang Huizao

2.2 标准曲线与检测限

配置系列不同浓度苯甲酸标准溶液，进样后利用色谱工作站绘制标准曲线，如图3，线性良好R2=0.9990。再选择合适的基线噪音范围，计算苯甲酸的信噪比，根据信燥比S/N=3计算仪器检出限为0.05mg/L，信燥比S/N=10计算仪器检测限为0.15mg/L（即为测定下限），再根据苯甲酸在前处理过程中的最终定容体积，通过计算得到该方法的检测限1.5mg/kg。

图3 苯甲酸标准曲线图Fig.3 Standard curve of benzoic acid

2.3 方法学考察

2.3.1 加标回收率

为验证该方法提取苯甲酸的准确性，分别对研究中选用的4种红枣进行了加标回收率的测定，实验重复3次，实验结果见表2。结果显示，采用该处理方式，提取红枣中苯甲酸，回收率分别为92.0%～105%、87.0%～103%、 78.8%～95.0%和80.9%～100%之间，回收率较高，可满足红枣样品中苯甲酸定量检测分析。

表1 加标红枣样品中苯甲酸测定结果（n=3）Table 1 Determination result of benzoic acid in spiked jujube sample（n=3）

2.3.2 精密度

为了考察方法的稳定性，选用新疆灰枣与新疆骏枣分别进行5次平行处理，提取苯甲酸进行测定，结果见表2，新疆灰枣1与新疆骏枣1进行5次平行处理测定结果计算精密度分别为4.87%和5.42%。

表2 红枣样品中苯甲酸测定结果（n=5）Table 2 Determination result of benzoic acid in jujube sample（n=5）

2.4 红枣产品的检测

本研究选用了市场上比较常见4种新疆红枣产品，对其进行分析检测，均有不同程度苯甲酸检出，如新疆灰枣中苯甲酸含量为25.6mg/kg和39.1mg/kg，新疆骏枣中苯甲酸含量为101mg/kg和104mg/kg，明显高于灰枣中苯甲酸含量。这种含量水平显著低于《食品安全国家标准食品添加剂使用标准》（GB 2760-2014）中规定的苯甲酸添加浓度限量，然而《食品添加剂使用标准》未对红枣产品中苯甲酸做限量规定，即为红枣产品中不得添加（或检出）苯甲酸。已有文献报道果蔬产品中可天然生成苯甲酸[17,18]，并有研究人员绘制了天然苯甲酸的生成途径，探讨了生成的机制[19,20]。红枣中苯甲酸的检出不仅为下一步食品安全标准的制修订提供了一份重要的素材，更为食品安全产业发展抛出了一个新课题。

3 结论

本研究建立了一种以水溶液直接浸提高效液相色谱法检测红枣中苯甲酸的方法。采用剪切-均质-超声三种方式相结合的提取方法，快速、有效的提取了红枣中的苯甲酸，以甲醇：水（含0.15%乙酸铵）=5∶95时苯甲酸出峰峰型最佳，且分析速度快。对实际红枣样品进行加标回收试验与重复性检测，结果显示，该处理方式对苯甲酸回收率稳定，精密度高，方法线性良好，方法测定下限可满足红枣样品中苯甲酸的检测需求，为准确快速掌握红枣样品中苯甲酸含量水平、进一步探究红枣中苯甲酸成因提供了更可靠的分析手段。

[1]李菊,刘淑君,黄雪琳.苯甲酸和苯甲酸钠安全性与检测方法研究进展[J].粮食与油脂,2012,(9)∶49-51.

[2]唐文强,刘长海.天然苯甲酸生物合成机制的研究进展[J].中国调味品,2011,8(36)∶12-15.

[3]顾晓莉.HPLC测定食品中苯甲酸和山梨酸[J].轻工标准与质量,2013,(2)∶36-37.

[4]Nagayama T,Nishjiima M,Yasuda K,Saito K,Kamimura H,Ibe A,Benzoic acid in agricultural of food Produets and Proeessed food. Journal-Food Hygienie Sociey of JaPan.1998,(27)∶316-325.

[5]Nagayama H,Naoi Y M,Benzoic acid in fruits and fruit products. J.Food Hyg.Sot.Japan,1983,(24)∶416-22.

[6]杜业刚,李碧芳,邓武剑,等.食品中天然产生的化学污染物本底值分析[J].中国食品添加剂,2013,(2)∶165-168.

[7]Sieber R,Butikofer U,Bosset J O and Ruegg M,Benzoic Acid as a Natural Component of Foods.MitteiIungen aus dem Gebieteder Lebensmitteluntersuehung und Hygiene,1989,(80)∶345-362.

[8]Harbonre J B,Plant and ufngal toxins.NewYork∶NY Mareel Dekke,1983,(1)∶755-758.

[9]魏明.向仲朝.HPLC测定食品中苯甲酸、山梨酸、糖精钠的样品前处理[J].食品科技,2006,(9)∶240-241.

[10]周毅刚,龙苏,王晓春,等.高效液相色谱测定食品中苯甲酸、山梨酸含量[J].中国医师杂志,2001,3(3)∶184-188.

[11]赵一晖,刘建伟,顾晓莉,等.高效液相色谱法测定食品中山梨酸和苯甲酸[J].中国卫生工程学,2006,5(6)∶348-349.

[12]王俊红.食品添加剂苯甲酸检测方法研究进展[J].粮食与油脂,2010,(12)∶37-38.

[13]郑玲,杨健,吕春秋,等.马燕娟高效液相色谱法测定凉粉草中的苯甲酸[J].轻工科技,2013,(6)∶9-10.

[14]王毕尼.红枣多酚的抗氧化活性[D].杨凌∶西北农林科技大学,2011.

[15]温凤英.红枣色素提取及化学成分[D].福州∶福建农林大学, 2011.

[16]李华勇.食品中苯甲酸检测新技术的现状 [J].江西科学, 2010,28(6)∶775-778.

[17]唐文强,刘长海.豆豉中天然苯甲酸的生成途径研究 [J].广东农业科学,2011,(17)∶79-80.

[18]Effmert U,Saschenbrecker S,Ross J,et al.Floral benzenoid carboxyl methyltransferases∶from in vitro to in planta function.[J].Phytochemistry,2005,(66)∶1211-1230.

[19]Wildermuth,Mary C.Variations on a theme∶synthesis and modiucation of plant benzoic acids[J].Current Opinion in Plant Biology,2006,(9)∶288-296.

[20]Abd El-Mawla A M,Schmidt W,Beerhues L, Cinnamic acid is a precursor of benzoic acids in cell cultures of Hype-ricum and rosaemum L.but not in cell cultures of Centaurium erythraea RAFN[J].Planta,2001, (212)∶288-293.

Determination of Benzoic Acid in Jujube by High Performance Liquid Chromatography

ZHENG Xiao-dong SONG Ye PAN Shao-xiang MENG Xiao-meng LIU Xue-meiYAN Xin-huan
(Jinan Fruit Research Institute,All China Federation of Supply&Marketing Co-operatives,Jinan 250014,China)

In the paper,a water direct extraction combined HPLC method was developed for the determination of benzoic acid in jujube.The combination pretreatment of cut-homogenization-ultrasound was adopted.Different influencing factors such as the proportion of mobile phase were studied.Based on this,real samples determination and recovery experiments were carried out.The result showed that the the mobile phases were methanol and 0.15%ammonium acetate aqueous solution(5:95,v/v).Under these conditions,the peak shape was presented well with an appropriate retention time and rapid measurement.The recoveries were 78.8%～105%,and the RSDs were 4.87%～5.42%.The linearity is good in detection(2= 0.9990),and LOQ (=10)was 1.5mg/kg.This method can meet the need for the quantitative detection of benzoic acid in jujube.

Jujube;benzoic acid;high performance liquid chromatography(HPLC)

TS255.3

A

1008-1038(2015)10-0033-04

2015-03-21

国家科技支撑计划课题枣和桑资源生态高值利用技术研究与产品开发(2012BAD36B07）

郑晓冬（1983—），男，助理研究员，研究方向为食品质量安全与控制