银纳米粒子增强荧光法测定水体中痕量的恩诺沙星

孙雪，张晓辉，邱杰，蔡逸龙，周坤芳，张勇，王萍

分析测试

银纳米粒子增强荧光法测定水体中痕量的恩诺沙星

孙雪1，张晓辉1，邱杰1，蔡逸龙1，周坤芳1，张勇2，王萍1

（1. 温州医科大学环境与公共卫生学院，浙江 温州 325035； 2. 厦门大学环境科学研究中心，福建 厦门 361005）

在实验条件下建立了水溶液中痕量恩诺沙星的荧光分析方法；在课题组已有工作的基础上，采用“绿色”化学方法合成了银纳米粒子；研究了所制得的银纳米粒子对水溶液中恩诺沙星荧光行为的影响，并最终建立了水溶液中痕量恩诺沙星的银纳米粒子增强荧光分析方法。

恩诺沙星；荧光行为；银纳米粒子增强荧光

金属纳米材料由于兼具本身固有的物理化学性质和纳米尺度的特殊效应，使其在电学、光学、催化、摩擦学、生物材料等诸多领域都具有十分广泛的应用[1]。已有研究表明，金属纳米结构表面形成的等离子体能够通过分子附近局域电场的增强使分子的激发光电场得到增强，从而提高分子的激发强度和效率[2]。银纳米粒子因其特有的光电磁性质、催化特性以及在微电子学领域中的潜在应用前景而被广泛关注，有文献报道研究了银纳米粒子对荧光物质荧光特性的影响[3,4]。

恩诺沙星（enrofloxacin，ENX）是人工合成的第3代氟喹诺酮类抗菌药物，具有抗菌谱广、杀菌活性强、体内分布广、抗菌作用独特、生物利用度高、毒副作用小、无交叉耐药性等特点[5-7]。但长期应用恩诺沙星所产生的不良反应、畜禽产品中的残留以及在环境中的生态效应等方面的问题也已引起了广泛关注[8]。目前对于恩诺沙星的检测多采用高效液相色谱法（HPLC）或液相色谱-质谱联用法（LC-MS）等理化检测方法，但这些方法所需设备昂贵、操作繁琐且灵敏度有限[9]。荧光分析法具有灵敏度高、选择性好、方法简便、重现性好、设备简单、价格低廉等优点。恩诺沙星具有共轭结构和刚性，适应于荧光分析法进行相关研究。

本文首先在实验条件下建立了水溶液中痕量恩诺沙星的荧光分析方法，然后在课题组已开展工作的基础上，采用“绿色”化学方法合成了银纳米粒子[10,11]，并将此银纳米粒子引入到恩诺沙星荧光行为的研究中，初步考察了其对水溶液中恩诺沙星荧光行为的影响，最终建立了水体中痕量恩诺沙星的银纳米粒子增强荧光分析方法。

1 实验部分

1.1 试剂与仪器

H-7500透射电子显微镜（日本日立公司）；制造有限公司）；岛津RF-5310型荧光分光光度计（日本岛津公司）。

硝酸银（AR，上海国药集团化学试剂有限公司）；恩诺沙星（纯度为99.6%，中国药品生物制品检定所）；葡萄糖（AR，国药集团化学试剂有限公司）；氨水（AR，国药集团化学试剂有限公司）；β-CD（≥97%，国药集团化学试剂有限公司）。

1.2 银纳米粒子的制备与表征

在课题组已有工作基础上，以β-CD为稳定剂，葡萄糖为还原剂采用“绿色化学方法”合成了银纳米粒子[8,9]。研究纳米颗粒粒径、粒度分布以及颗粒形状有多种方法。本实验直接将银纳米溶液滴在碳膜处理的铜网上，自然晾干后采用透射电子显微镜进行直接观察。

1.3 荧光强度的测定

实验首先将恩诺沙星的水溶液与银纳米溶液均匀混合，加超纯水稀释，然后立即放入荧光分光光度计中测量其荧光强度。在进行荧光测定时，保持混合液中恩诺沙星的浓度为0.01mg·L-1，所有荧光光谱的获得均在室温下进行，测量过程中激发和发射狭缝均保持为5nm。

1.4 考察银纳米粒子对恩诺沙星荧光行为的影响

取适量恩诺沙星母液，分别加入体积分数为0、5%、10%、15%、20%、30%、40%、50%、75%、100%的银纳米溶液，再加入适量超纯水，配置成一系列10 mL 0.01 mg·L-1的恩诺沙星样品溶液，然后分别进行荧光检测。

2 结果与讨论

2.1 恩诺沙星荧光分析方法的建立

图1 恩诺沙星的荧光激发（λem＝446 nm）和发射（λex＝278 nm）谱图Fig.1 Fluorescence excitation (λem＝446 nm) and emission (λex＝278 nm) spectra of ENX in waters

实验首先扫描了恩诺沙星水溶液的激发和发射光谱图（如图1所示）。由图1可知，水溶液中恩诺沙星的最大激发（λex）和发射波长（λem）分别为278 nm和446 nm。另外，从图中可以明显看出在检测波长条件下，空白溶液的自发荧光非常弱，不干扰荧光光谱法对恩诺沙星的检测。因此，实验考察了不同浓度恩诺沙星的荧光强度，实验结果表明，恩诺沙星荧光强度随着溶液浓度的增大而增强。图 2为根据恩诺沙星浓度与其荧光强度关系所建立的标准工作曲线，实验结果表明，标准工作曲线的线性拟合方程为y= 11142x+ 21.759，R2值为0.997 8，恩诺沙星溶液浓度在0.001～0.08 mg·L-1范围内具有良好的线性。检出限为6.1×10-5mg·L-1相对标准偏差为1.66%，加标回收率的范围在94%～103%之间。综合考虑，选择0.01 mg·L-1的浓度进行后续实验。

图2 恩诺沙星的荧光强度随其浓度的变化曲线Fig.2 Curve of fluorescence intensities of the ENX to the change of its concentration

2.2 银纳米粒子的制备

本实验制得的银纳米溶液为油黄色溶胶，该银溶胶在常温、不避光条件下可以稳定保存2个月以上，而不会发生聚沉现象。且实验制得的银纳米粒子为类球形，粒径小且粒度分布范围窄，分散性好，平均粒径约为31 nm[10,11]。

2.3 银纳米粒子对恩诺沙星荧光行为的研究

为了考察制得的银纳米粒子对水溶液中恩诺沙星荧光行为的影响，实验分别考察了不同体积分数的银纳米溶液对恩诺沙星溶液的荧光行为的影响。实验结果表明，随着加入银纳米溶液体积的增大，恩诺沙星荧光发射峰的峰型和位置基本没有发生变化，而荧光强度则呈现先增强后减弱的趋势，当加入的银纳米溶液体积分数为50%时，恩诺沙星溶液的荧光强度最强，表明制得的银纳米粒子对恩诺沙星水溶液既具有荧光猝灭作用又具有较强的荧光增敏作用（如图3所示）。由于在银纳米粒子的制备过程中，β-CD只作为保护剂，没有参加化学反应，因此实验最后制得的是银纳米粒子和β-CD的混合物。而有文献报道，由于β-CD的特殊分子结构，其可以作为荧光增敏剂，并且相关研究也越来越多[12,13]。为了消除β-CD对本实验的干扰，考察了相同实验条件下β-CD对恩诺沙星水溶液荧光行为的影响。结果表明，不同浓度的β-CD对恩诺沙星水溶液的荧光强度影响也不同，既有增强也有减弱现象（如图 3所示）。因此，实验选取加入体积分数为50%的银纳米溶液进行后续实验。

图3 不同体积分数的银纳米粒子和β-CD对水溶液中恩诺沙星荧光强度的影响Fig.3 Effect of different volume fraction of silver nanoparticle and β-CD on the fluorescence behaviors of the ENX in water

2.4 银纳米粒子存在下恩诺沙星荧光分析方法建立

图4 银纳米粒子存在条件下恩诺沙星溶液的荧光强度随其浓度的变化曲线Fig.4 Curve of fluorescence intensities of the ENX to the change of its concentration in the presence of silver nanoparticle

实验分别用体积分数为50%的银纳米溶液配制成一系列浓度的恩诺沙星待测液，在λex= 278.0 nm，λem=446nm处测定其荧光强度，并根据恩诺沙星浓度对荧光强度绘制标准工作曲线，线性拟合方程为y = 11227x + 35.367，R2值为0.995 4，待测恩诺沙星溶液浓度在 0.000 1～0.08 mg·L-1范围内具有良好的线性（如图 4所示）。其中检出限为 5.9×10-6mg·L-1，相对标准偏差为1.57%，加标回收率的范围在102%～107%之间。因此，本实验中银纳米粒子存在条件下建立的水溶液中恩诺沙星荧光分析方法比不加银纳米粒子时所建方法的最低检出浓度低约10倍。故采用银纳米粒子增强荧光法所建立的分析方法可以检测水体中更低浓度的恩诺沙星，因而具有更广泛的应用价值。

3 结 论

本研究首先在实验室条件下建立了水溶液中痕量恩诺沙星的荧光分析方法；其次，在课题组已开展工作的基础上，采用“绿色”化学方法合成了银纳米粒子，并考察了制得的银纳米粒子对水溶液中恩诺沙星荧光行为的影响。

实验结果表明，银纳米粒子加入体积分数为50%时，对水溶液中恩诺沙星具有最强的增敏效应；最后，建立了水溶液中痕量恩诺沙星的银纳米粒子增强荧光分析方法，此方法比不加银纳米粒子时所建分析方法得到水溶液中恩诺沙星的最低检出浓度低约10倍。

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A Silver Nanoparticle-Enhanced Fluorimetry for Determination of Trace Enrofloxacin in Water

SUN Xue1, ZHANG Xiao-hui1, QIU Jie1, CAI Yi-long1, ZHOU Kun-fang1, ZHANG Yong2, WANG Ping1*
（1. School of Environmental Science and Public Health, Wenzhou Medical University, Zhejiang Wenzhou 325035, China；2. Department of Environmental chemistry, Xiamen University, Fujian Xiamen 361005, China）

Firstly, a fluorimetry for determination of trace enrofloxacin in water was established in laboratory conditions. Secondly, the silver nanoparticle was synthesized based on our previous studies. In addition, effect of silver nanoparticle on the fluorescence behavior of enrofloxacin in water was investigated. Finally, a silver nanoparticle-enhanced fluorimetry for determination of trace enrofloxacin in water was also established.

Enrofloxacin; Fluorescence behavior; A silver nanoparticle-enhanced fluorimetry

O 657

： A

： 1671-0460（2015）04-0855-03

国家自然科学基金项目，项目号：21207103；浙江省大学生科技创新活动计划暨新苗人才计划，项目号：2013R413010；浙江省公益项目，项目号：2012C31025)。

2014-11-14

孙雪，女，山东济南人，研究方向：有机污染物的分析方法研究。E-mail：1026033690@qq.com。

王萍（1981-），女，副教授，博士，研究方向：有机污染物的迁移转化行为研究。E-mail：wangping_xmu@163.com。