健脾生血颗粒对肾性贫血模型大鼠的治疗作用

谭静玲， 赵 刚 ， 吕承恬， 熊富良， 陈 兴， 张雪琼

(1. 湖北省食品药品监督检验研究院，湖北 武汉430064;2. 健民药业集团儿童药物研究院，湖北 武汉430052;3. 武汉理工大学化学化工与生命科学学院，湖北武汉430070)

肾性贫血主要是由于促红细胞生成素减少所致，中医视为肾精不足。而健脾生血颗粒具有健脾填精、益气养血之功效，因此，基于精血同源理论，健脾生血颗粒可能对治疗肾性贫血有效果，但需要通过动物实验进行验证。本实验通过建立肾性贫血模型，旨在考察健脾生血颗粒对肾性贫血大鼠模型的治疗效果，为健脾生血颗粒的二次开发提供参考。

1 材料

1.1 动物 Wistar 大鼠50 只(SPF 级)，购自湖北省实验动物研究中心，合格证号SCXK2008-0005。于实验前饲养3 d 以适应本实验动物室环境后称量，大鼠体质量为180 ～220 g。

1.2 试剂 健脾生血颗粒(生产批号20131211，武汉健民药业集团股份有限公司，相当于生药0.36 g +硫酸亚铁0.02 g/g);健脾生血浸膏(原处方中药部分，相当于生药材3.27 g/g);六水合硫酸亚铁(生产批号20130116，国药集团化学试剂有限公司)。

1.3 仪器 紫外分光光度计(SP-1920，上海光谱仪器有限公司);电子称(JS-S，昆山天金岗金属制品有限公司);离心机(TGL-16，常州市万合仪器制造有限公司);电子天平(FA2004，上海方瑞仪器有限公司);全自动血液分析仪(美国库尔特);自动生化分析仪(CXT，美国贝克曼);酶标仪(BIO-BAD BECHMARK)。

2 实验方法

2.1 造模与给药 大鼠经适应性饲养3 d，腺嘌呤［1］用去离子水配制3%的混悬液，灌胃剂量为10 mL/kg，每天1次，连续灌胃6 周，制作肾性贫血模型［2-4］。依据动物剂量换算表设定，实验组大鼠等效剂量为人用剂量的6.3 倍，各组给药剂量按照下列公式计算。健脾生血组给药量=6.3 ×0.214 ×大鼠体质量(按成人70 kg 计，每天剂量为15 g，成人每天服药剂量为0.214 g/kg);健脾生血浸膏组给药量=6.3 ×0.214 ×0.11 ×大鼠体质量(每克颗粒相当于浸膏0.11 g);硫酸亚铁组给药量=6.3 ×0.214 ×0.0198 ×大鼠体质量;正常对照组和模型组给予等剂量的0.9%氯化钠溶液，每只大鼠给药2 mL。6 周后，眼眶采血测定血象指标，实验组的血象指标均显著低于正常对照组水平，即显示造模成功。

2.2 样本采集和指标测定

2.2.1 血象指标 分别于灌胃给药前后眼眶采血2 mL，采用全自动血液分析仪检测RBC、HGB、HCT。

2.2.2 血清中促红细胞生成素 (EPO)的测定 按照ELISA 试剂盒操作说明进行EPO 的［5］测定。取大鼠眼眶血收集于离心管中，将装有血液的离心管横在实验台，于室温下自然凝固，再放入冰箱4 ℃下凝固，离心。仔细收集上清。检查上清液如果仍有红色沉淀，应吸取上清液再次离心［6-8］。

2.2.3 肾功能检查 眼眶采血后，采用Beckmann 自动生化分析仪测定BUN 及Cr［9-12］，进行肾功能检查。

2.2.4 红细胞脆性试验 麻醉后处死大鼠，眼眶取血，立即取0.9%氯化钠、0.44%氯化钠和纯水各2.5 mL，分别加入全血50 μL 混匀，离心，取上清液在紫外分光光度法波长575.2 nm 处测定，计算红细胞溶解率［13］。

2.3 统计学处理 采用SPSS 19.0 软件对数据进行处理，以±s 表示，各组之间比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA)检验，以P ＜0.05 为有显著性差异。

3 实验结果

3.1 对大鼠血液学指标的影响

3.1.1 对外周血红细胞(RBC)的影响 造模6 周后，与正常对照组相比，其余组RBC 水平显著较低(P ＜0.05)，即示造模成功。灌胃给药后，除模型组外，其余各组RBC水平均显著上升(P ＜0.05)，且健脾生血颗粒组和健脾生血浸膏组恢复至正常对照组水平。硫酸亚铁组RBC 水平有所恢复但尚未恢复到正常水平。健脾生血颗粒组明显高于其他各组(见表1)。

3.1.2 对大鼠血红蛋白(HGB)的影响 造模后，与正常对照组比较，其余组明显低于正常对照组(P ＜0.05)。给药后，各组水平均有上升，且各组间差别显著 (P ＜0.05)。硫酸亚铁组有所上升但尚未恢复到正常水平(见表1)。

3.1.3 对大鼠红细胞比容(HCT)的影响 造模后，除正常对照组外，各组HCT 水平显著下降，(P ＜0.05)。给药后，除硫酸亚铁组外，其余各组与正常对照相比均显著升高(P ＜0.05)。各组间相比，HCT 差异显著，具有统计学意义(P ＜0.05)。健脾生血颗粒组效果明显高于健脾生血浸膏组和硫酸亚铁组，升高情况有显著性差别(P ＜0.05)(见表1)。

表1 大鼠给药后对血常规的影响(±s，n=8)

表1 大鼠给药后对血常规的影响(±s，n=8)

注:与正常对照组比较，▲P ＜0.05，与模型组比较，*P ＜0.05

组别 时间 RBC/(×1012·L -1) HGB/(g·L -1) HCT/%模型组 给药前 5.13 ±0.28▲ 95.73 ±2.74▲ 28.48 ±1.18▲给药后 5.07 ±0.53 97.25 ±2.70 28.43 ±1.86▲正常对照组 给药前 6.91 ±0.24 99.00 ±2.38 33.40 ±1.51给药后 7.00 ±0.24* 121.10 ±2.50* 34.23 ±0.93*健脾生血颗粒组 给药前 5.00 ±0.31▲ 95.73 ±3.77▲ 31.42 ±1.51▲给药后 8.68 ±0.36* 137.67 ±4.59* 39.70 ±1.48▲＊健脾生血浸膏组 给药前 5.05 ±0.35▲ 94.82 ±1.50▲ 27.27 ±0.70▲给药后 7.44 ±0.15* 125.50 ±1.49* 36.37 ±0.70▲＊硫酸亚铁组 给药前 5.02 ±0.22▲ 95.58 ±2.66▲ 25.92 ±1.12▲给药后 6.84 ±0.33* 119.90 ±5.14* 35.07 ±1.11*

3.2 对大鼠EPO 的影响 给药后，取大鼠眼眶血收集于离心管中，将装有血液的离心管横在实验台，自然凝固，再放入4 ℃下凝固，离心。收集上清。检查上清液若仍有红色沉淀，应吸取上清液再次离心。健脾生血颗粒组大鼠EPO 的量低于正常对照组，但显著高于健脾生血浸膏组和硫酸亚铁组(P ＜0.05)，各组大鼠EPO 含有量见表2。

表2 大鼠给药后对EPO 的影响(±s，n=8)

表2 大鼠给药后对EPO 的影响(±s，n=8)

注:与正常对照组比较，▲P ＜0.05;与模型组比较，* P ＜0.05

组别 给药前/(mmol·L -1)给药后/(mmol·L -1)模型组 10.66 ±0.24▲ 10.16 ±0.93正常对照组 16.88 ±0.90 16.64 ±0.92*健脾生血颗粒组 10.73 ±0.16▲ 14.64 ±0.88*健脾生血浸膏组 10.60 ±0.22▲ 13.32 ±0.83*硫酸亚铁组 10.55 ±0.17▲ 12.03 ±0.56*

3.3 对大鼠肾功能的影响 给药后，除模型组外，各组大鼠BUN 的量均有所下降，提示三组大鼠肾功能均有所恢复。三组间BUN 的量存在统计学差异，其中健脾生血颗粒组BUN 的量最低，健脾生血浸膏组、硫酸亚铁组稍高，但均未降低到正常对照组水平。大鼠肌酐(Cr)水平变化趋势与BUN 变化趋势基本吻合。进一步印证了大鼠肾功能的变化。大鼠BUN、Cr 的量如表3、表4。

3.4 对大鼠红细胞脆性的影响 麻醉后处死大鼠，眼眶取血，立即取0.9%氯化钠、0.44%氯化钠和纯水各2.5 mL，分别加入全血50 μL 混匀，离心，取上清液在紫外分光光度法波长575.2 nm 处测定，计算红细胞溶解率。大鼠通过灌胃健脾生血颗粒和健脾生血浸膏恢复至正常水平。虽然硫酸亚铁组大鼠红细胞溶解率未恢复到正常值，但给药后仍降低，接近正常值。见表5。

表3 大鼠给药后对BUN 的影响(±s，n=8)

表3 大鼠给药后对BUN 的影响(±s，n=8)

注:与正常对照组比较，▲P ＜0.05;与模型组比较，*P ＜0.05

组别 给药前/(mmol·L -1)给药后/(mmol·L -1)模型组 26.71 ±5.44▲ 26.05 ±6.74正常对照组 10.37 ±0.59 10.40 ±0.61*健脾生血颗粒组 25.13 ±5.41▲ 11.87 ±2.04*健脾生血浸膏组 26.23 ±4.99▲ 16.00 ±2.89*硫酸亚铁组 25.39 ±5.52▲ 17.56 ±2.27*

表4 大鼠给药后对Cr 的影响(±s，n=8)

表4 大鼠给药后对Cr 的影响(±s，n=8)

注:与正常对照组比较，▲P ＜0.05;与模型组比较，*P ＜0.05

组别 给药前/(μmol·L -1)给药后/(μmol·L -1)模型组 140.17 ±11.14▲ 144.89 ±11.26正常对照组 76.77 ±8.86 79.54 ±8.26*健脾生血颗粒组 141.90 ±11.28▲ 90.90 ±6.57*健脾生血浸膏组 143.47 ±10.56▲ 101.22 ±7.18*硫酸亚铁组 141.57 ±8.93▲ 112.88 ±6.24*

4 讨论

本实验考察肾性贫血大鼠给药前后血象指标(RBC、HGB、HCT)、EPO、肾功能指标(BUN、Cr)、红细胞脆性，给药后，除模型组外，实验组三组大鼠的外周血象指标水平均已基本恢复至正常对照组水平，且健脾生血颗粒组、健脾生血浸膏组和硫酸亚铁组间血象指标水平存在显著差异。健脾生血颗粒效果优于其余两组。由此可见，健脾生血颗粒能明显提高EPO 的量，降低BUN、Cr 的量，有效治疗大鼠肾性贫血并能改善肾功能，并可降低红细胞脆性。健脾生血颗粒中的中药浸膏部分和硫酸亚铁部分均可改善肾性贫血，但单独使用效果不如健脾生血颗粒，可以初步推测，健脾生血颗粒中药部分与硫酸亚铁协同作用于肾性贫血大鼠的治疗。

表5 大鼠给药后对红细胞溶血率的影响(±s，n=8)

表5 大鼠给药后对红细胞溶血率的影响(±s，n=8)

注:与正常对照组比较，▲P ＜0.05;与模型组比较，* P ＜0.05

组别 给药前/% 给药后/%模型组 64.50 ±2.37▲ 64.20 ±1.90正常对照组 53.45 ±2.78 53.87 ±2.34*健脾生血颗粒组 64.03 ±1.97▲ 54.07 ±6.15*健脾生血浸膏组 64.97 ±2.12▲ 54.27 ±4.99*硫酸亚铁组 64.55 ±2.50▲60.95 ±2.14

［1］ 董志刚，马晓燕，姚春雷，等. 温肾益精降浊法方药治疗腺嘌呤致大鼠肾性贫血的实验研究［J］. 中国中医药科技，2010，17(4):302-303.

［2］ 张晓东，宋保利，方敬爱，等. 活血复肾胶囊对慢性肾衰竭大鼠肾性贫血的影响［J］. 中国中西医结合肾病杂志，2006，7(5):267-268.

［3］ 陈 新，张 丽，罗分平. 丹芍汤对大鼠肾性贫血的治疗作用［J］. 中华中医药学刊，2010，28(5):1086-1087.

［4］ 李 靖，吴云霞，王 晶. 鬼针草治疗大鼠肾性贫血的实验研究［J］. 中西医结合研究，2009，1(5):233-235.

［5］ 刘茂玄，罗 洁，王东亮，等. 复方阿胶浆对肾性贫血大鼠的治疗作用及其机制［J］. 中草药，2014，45(3):380-381.

［6］ 汪 军，郑佳新，张春戬. 肾血康对肾性贫血大鼠外周血象与红细胞脆性及EPO 含量的影响［J］. 中国中西医结合肾病杂志，2004，5(4):195-196.

［7］ 刘海虹，何学红. 补肾生血颗粒对实验性慢性肾衰大鼠血EPO 及TNF 的影响［J］. 辽宁中医药大学学报，2006，8(4):137-138.

［8］ 袁 钢，魏连波，李玉明，等. 肾衰养真胶囊对肾衰贫血大鼠及EPO 基因表达的影响［J］. 中成药，2005，27(7):836-837.

［9］ 李永新，孟陆亮，张延英，等. 益气化湿胶囊对腺嘌呤肾衰大鼠BUN、SCr 及造血功能的影响［J］. 中医研究，2010，23(5):17-18.

［10］ 曾海飞，何泽云，徐 琴，等. 六味地黄汤对5/6/肾切除大鼠肌酐、尿素氮及24 h 尿蛋白定量的影响［J］. 湖南中医杂志，2013，29(8):114 -115.

［11］ 郭冰云，徐美华，许浩彬. 不同光照制对大鼠血清尿酸、尿素氮、肌酐含量昼夜节律的影响［J］. 福州医科大学学报，1998，32(2):136-137.

［12］ 李香兰，祁海峰，刘 凯，等. 黄芪水提取液对运动后小鼠肌糖原和血清中肌酐含量的影响［J］. 延边大学医学学报，2009，32(4):235-236.

［13］ 李利根，郭振荣，赵 霖，等. 补锌对烫伤大鼠血清锌、铁和红细胞脆性的影响［J］. 军医进修学院学报，1999，20(1):32-33.