玉米C4型PEPC全长基因的克隆与表达载体构建

王雷+崔震海+张立军

摘要：以玉米自交系郑58基因组DNA为模板，设计了2对特异性引物，分别PCR扩增玉米C4型磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（PEPC）启动子及其全长编码序列，利用In-Fusion技术将两者定向克隆到载体pCAMBIA-1391Z上，并对重组子进行测序验证。结果表明，该PEPC启动子序列与GenBank中的玉米自交系B73的同源性为97.70%，片段长1200bp；全长编码序列同源性为97.90%，片段长6330bp。通过HindⅢ和EcoRⅠ酶切载体pCAMBIA-1391Z，利用In-Fusion技术将线性载体与之前获得的2个PCR片段连接，测序结果与预期序列一致，表明成功构建了pCAMBIA-1391Z-PEPC植物表达载体。对克隆和载体构建中存在的问题进行了讨论，以期为该类型基因的高效克隆及表达载体的构建提供参考、为C4型PEPC基因功能研究和C3植物遗传转化提供可用的基因序列。

关键词：玉米；PEPC；基因克隆；序列分析；表达载体构建

中图分类号：Q786；S513.01文献标志码：A文章编号：1002-1302（2014）11-0026-04

根据CO2固定初始产物的不同，可将高等植物分成C3、C4、CAM这3类。以三碳化合物3-磷酸甘油酸为最初光合产物的光合途径为C3途径（或卡尔文循环），以四碳化合物草酰乙酸为最初光合产物的光合途径为C4途径。C4途径具有CO2浓缩机制，能高效利用大气中的CO2，使植物保持较高的光合效率[1-3]，因此人们大量开展了将C3植物转化为C4植物的研究，但是许多这类转化没有达到预期目的[4]。

磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（PEPC）存在于所有能进行光合作用的有机体中，包括植物、绿藻和光合细菌等。根据其序列特征和功能结构，PEPC基因可划分为C4、C3-1、C3-23个亚族，其中C4型主要在叶肉细胞的胞质中表达，并且受光照调控，C3-1型主要在黄色叶片、茎等部位表达，C3-2型主要在根部表达；C4型的PEPC基因由C3型PEPC基因进化而来[5-7]。研究表明，将杂交玉米品种（GoldenCrossBantam）的C4型PEPC全长基因（包括自身的启动子）转入C3植物，PEPC酶活性提高了2～110倍，苹果酸浓度也提高了，光合速率在强光条件下明显提高。研究还发现，转玉米PEPC基因cDNA和水稻Cab启动子的嵌合基因的水稻仅能使光合作用效率提高数倍，而将完整的玉米PEPC基因（包括外显子、内含子及自身的启动子）转入水稻中则能数十倍或更高地提高其光合效率[8-17]。这说明以嵌合基因形式转化C3植物，即cDNA和组成型启动子CaMV35S或光诱导型Cab启动子，或采用C4全长基因和自身启动子进行转化，对基因更好地表达和作用的发挥是十分必要的。

另外，C4关键酶基因由于序列较长，即使成功克隆，也不容易连入表达载体。在传统载体构建方法中，需要将基因的2个末端经过酶切修饰后插入载体，不仅要寻找合适的酶切位点，而且操作复杂，通常还需要构建多个中间载体，并进行多次酶切连接转化，工作量较大而且构建效率较低，尤其不适合构建长片段、多片段拼接的复杂载体。In-Fusion是近年来发展起来的高效率载体构建技术，已应用于多基因融合和长片段克隆等方面[18]，运用该技术进行基因克隆和载体构建时，不需要借助T4DNA连接酶和补平DNA片段末端等操作步骤，只是在PCR引物设计中分别引入载体酶切位点两端的各15bp序列，在In-Fusion重组酶作用下将PCR产物和已经线性化的载体连接起来，从而完成载体构建。In-Fusion技术对目的片段和载体没有特殊的要求，可以将任何目的基因连接到线性化载体上。

玉米的C4型PEPC基因序列较长，同时还需要连入启动子，多片段连接表达载体存在困难。因此，本研究利用PCR技术扩增玉米C4型PEPC全长编码序列及其启动子序列，结合In-Fusion技术一步成功构建表达载体，并对克隆和载体构建中存在的问题进行讨论，以期为该类型基因的高效克隆及表达载体的构建提供参考，进而为C4型PEPC基因功能的研究和C3植物的遗传转化提供可用的基因序列。

1材料与方法

1.1植物材料、菌株和载体

玉米（ZeamaysL.）自交系郑58、pCAMBIA-1391Z植物表达载体（图1）由笔者所在实验室保存，E.coliHST08Premium菌株购自宝生物工程（大连）有限公司。

1.2主要试剂

PrimeSTARGXLDNAPolymerase（CodeNo.R050Q）试剂盒、TaKaRaMiniBESTAgaroseGelDNAExtractionKitVer.3.0试剂盒（CodeNo.9762）、In-FusionHDCloningKit试剂盒、高效感受态细菌制备试剂盒E.coliCompetentCellsHST08Premium（CodeNo.9128）、各种限制性内切酶、DNAmarker均购自宝生物工程（大连）有限公司；植物基因组DNA提取试剂盒、琼脂糖凝胶回收试剂盒（DP209）、质粒提取试剂盒均购自天根生化科技（北京）有限公司；所用引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.3引物设计

根据In-Fusion技术原理，利用NCBI上已经发表的玉米C4光合关键酶PEPC基因全长DNA序列（GenBank号：CM000785.3）和表达载体pCAMBIA-1391Z，设计并合成PEPC基因启动子及其全长编码序列的引物，详见表1。

1.4玉米C4型PEPC启动子及其全长编码序列的PCR扩增

采用以上引物和PrimeSTARGXLDNAPolymerase（CodeNo.R050Q）试剂盒，以玉米自交系郑58基因组DNA为模板，对PEPC基因启动子进行PCR扩增，50μLPCR总反应体系为：1μLDNA模板，10μL5×PrimeSTARGXLbuffer（Mg2+plus），4μLdNTPMixture（各2.5mmol/L），各0.5μL上下游引物（20pmol/μL），1μLPrimeSTARGXLDNAPolymerase（1.25U/μL），33μLddH2O。PCR扩增程序为：98℃变性10s，60℃退火15s，68℃延伸1min，共进行30个循环。同样，对PEPC基因全长编码序列进行PCR扩增，50μLPCR总反应体系为：1μLDNA模板，10μL5×PrimeSTARGXLbuffer（含Mg2+），4μLdNTPMixture（各2.5mmol/L），各0.5μL上下游引物（20pmol/μL），1μLPrimeSTARGXLDNAPolymerase（1.25U/μL），33μLddH2O。PCR扩增程序为：98℃变性10s，60℃退火15s，68℃延伸6min，共进行30个循环。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测后切下目的条带，用胶回收试剂盒回收用于后续试验。同时取PCR产物送生工生物工程（上海）股份有限公司进行测序。

1.5植物表达载体的构建

分别用HindⅢ、RcoRⅠ双酶切植物表达载体pCAMBIA-1391Z。50μL酶切反应体系为：5μLpCAMBIA-1391Z，5μL10×Mbuffer，1.5μLHindⅢ（10U/μL），1.5μLEcoRⅠ（10U/μL），37μLddH2O，37℃完全酶切16h。用琼脂糖凝胶电泳检测并切胶回收目的片段，利用In-FusionHDCloningKit（ClontechCodeNo.639633）试剂盒将“1.4”节中经过测序验证正确并回收的PEPC基因全长编码序列、PEPC基因启动子片段和线性载体pCAMBIA-1391Z片段连接，连接反应体系为：1μLPEPC基因扩增回收片段（约80ng/μL），1μLPEPC基因启动子扩增回收片段（约80ng/μL），1μLpCAMBIA-1391Z酶切片段，2μL5×In-FusionHDEnzymePremix，5μLddH2O。取1μL连接产物，热转化至E.coliCompetentCellsHST08Premium中，涂布平板，37℃过夜培养，挑取阳性克隆、提质粒、测序验证，所得载体命名为pCAMBIA-1391Z-PEPC。

2结果与分析

2.1玉米基因组DNA的提取

使用植物基因组DNA提取试剂盒提取的玉米基因组DNA，由图2的0.8%琼脂糖凝胶电泳与紫外检测结果看出，D260nm/D280nm在1.8～2.0之间，表明模板质量较高，符合后续试验要求。

2.2玉米C4型PEPC启动子及其全长编码序列的克隆

2.2.1目的片段的获得以玉米自交系郑58叶片DNA为模板，通过PCR分别扩增出2条大小约为1200bp（图3）、6330bp的特异性条带（图4），利用琼脂糖回收试剂盒（DP209）进行胶回收并测序。

2.2.2PCR产物测序结果的比对通过BLAST将测序结果与玉米B73相关序列进行比对，PEPC启动子PCR扩增产物与玉米B73PEPC启动子的比对结果见图5，经分析相似度达到97.70%；PEPC基因全长编码序列PCR扩增产物与玉米B73PEPC基因的比对结果见图6，经分析相似度达到97.90%。

由以上结果可以看出，试验用的玉米自交系郑58C4型PEPC基因及其启动子序列与已注册的玉米B73的序列相似度都在90%以上，可以用作后续载体构建。

2.2.3PEPC基因植物表达载体的构建采用In-Fusion克隆技术，将载体pCAMBIA-1391Z经HindⅢ/RcoRⅠ双酶切，获得的片段检测结果见图7，可见片段大小为11000bp。线性化载体pCAMBIA-1391Z、PEPC基因全长及其启动子在In-FusionHDEnzymePremix作用下重组，成功获得重组质粒pCAMBIA-1391Z-PEPC。将重组质粒热转化至E.coliCompetentCellsHST08Premium中，挑阳性克隆测序，结果表明，PEPC基因全长及其启动子已经成功插入到载体pCAMBIA-1391Z之中，测序结果与预期结果一致（图8），表明成功构建了植物表达载体pCAMBIA-1391Z-PEPC。

3讨论与结论

植物表达载体的构建在植物基因工程研究中占据重要地位，直接关系到目的基因的表达效果，因此选择方便与快捷的载体构建方法具有重要的意义。目前，人们已经发明了多种表达载体构建的方法，例如传统酶切连接方法、一步克隆法、Gateway技术等[19-20]。在构建表达载体过程中，首先需要对表达载体进行选择，常用的植物表达载体有pBI121、pBI221、pCAMBIA系列载体（载体的骨架是pUC18）。根据本试验克隆的PEPC基因全长编码序列及其启动子，笔者选择了没有

启动子序列的植物表达载体pCAMBIA-1391Z。多个目的片段插入植物表达载体常常受到酶切位点的限制，操作复杂，费时费力。与传统的载体构建方法相比，In-Fusion技术可以减少中间载体的构建，减少连接、转化次数，重组效率高；相对于Gateway技术来说，In-Fusion技术更简单，更快速。本研究采用In-Fusion技术进行目的片段克隆时，引物5′端设计与线性载体同源的15bp序列，通过PCR实现多目的片段与表达载体重组连接。试验中分别用HindⅢ/EcoRⅠ进行双酶切，利用In-Fusion酶将线性载体与之前获得的2个PCR片段连接，成功构建pCAMBIA-1391Z-PEPC植物表达载体，测序结果与预期序列一致。

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