农杆菌介导的玉米愈伤组织遗传转化影响因子和植株再生条件

张莹莹+吴连成+张赛赛+安允权+崔新建+陈彦惠

摘要：以HiⅡ、HiⅡB、HiⅡA、H99玉米材料的幼胚诱导的胚性愈伤为转化受体，利用农杆菌介导转化的方法，将抗粗缩病RNA干扰基因导入玉米愈伤组织，并对影响转化的因素进行研究，以优化遗传转化体系。结果表明：继代3次的4种玉米材料的抗性愈伤率最高，且不同品种间存在差异，HiⅡ的抗性愈伤率最高，为31.25%，其次为HiⅡB（26.56%）、HiⅡA（24.45%），H99的抗性愈伤率最低，仅为10.26%；预培养6d的愈伤组织适于转化，其中HiⅡ的抗性愈伤率最高，为27.70%；结果还表明，菌液浓度D600nm=0.5～0.6是最佳的转化条件。通过优化后的条件对得到的抗性愈伤用除草剂进行筛选，HiⅡ、HiⅡB、HiⅡA、H99材料分别得到10、5、4、3块抗性愈伤组织；标记基因为bar基因，通过PCR检测分别得到5、2、2、1块阳性愈伤组织，再进一步用bar基因试纸条检测，分别得到4、1、2、1株阳性植株。

关键词：农杆菌介导法；遗传转化；植株再生；抗性愈伤；bar基因

中图分类号：Q943.2；S513.03文献标志码：A文章编号：1002-1302（2014）11-0051-03

近年来，转基因技术已经在农业生产领域获得了极大的发展，利用转基因技术可以将外源基因整合到基因组中，从而改良农作物的性状。玉米是世界第三大粮食作物，广泛应用于食品、化学、医疗卫生等领域，它的遗传转化研究一直备受关注。

目前玉米转化的方法主要有基因枪法和农杆菌介导法。基因枪法花费成本比较大，转入的片段拷贝数多；而农杆菌介导法方法比较简单，且成本少、转化效率比较高、插入片段的拷贝数比较少，同时遗传比较稳定，因而被广泛采用。自1988年Rhodes等第1次获得完整的玉米转基因植株[1]以来，玉米的遗传转化体系取得了很大的进步和发展，目前国外许多转基因品种已经应用于农业生产领域，转化方法也越来越成熟。近年来，国内的转基因技术得到了重大的突破，黄璐等采用农杆菌侵染玉米单交种胚性愈伤组织成功，同时获得再生植株[2-3]；王国英等通过侵染玉米幼胚并将其诱导成愈伤，成功将Bt基因导入玉米中[4]。

本研究利用农杆菌介导法，用抗粗缩病的RNA干扰基因转化由HiⅡ、HiⅡB、HiⅡA、H99玉米材料诱导出的胚性愈伤组织，以转移粗缩病RNA干扰基因，结果得到了抗性愈伤组织并再生成苗。此外，试验对影响转化效率的部分因素进行了初步研究，优化了农杆菌转化玉米的条件，提高了农杆菌介导法对HiⅡ、HiⅡB、HiⅡA、H99玉米材料的转化效率，为今后培育抗病新品种打下基础。

1材料与方法

1.1试验材料

玉米材料HiⅡ、HiⅡB、HiⅡA、H99中由中国农业大学赖锦盛教授赠送，于2013年4月下旬至5月中旬分期播种于河南农业大学科教园区。载体为RNA干扰抗玉米粗缩病载体。

1.2试验方法

取HiⅡ、HiⅡB、HiⅡA、H99玉米材料授粉10d左右、大小为1～2mm的未成熟幼胚，盾片向上放置于基本培养基上进行诱导，每2周继代1次，约45d后形成稳定的愈伤组织。分别用继代3、4、5、6、7次的4种基因型玉米的愈伤组织进行侵染转化，侵染后的愈伤组织经选择培养基筛选2次，最后获得抗性愈伤组织，计算抗性愈伤率。分别选取继代3次，预培养2、5、6、8、10d的4种玉米材料愈伤进行侵染，通过3次抗性筛选后，计算抗性愈伤率。将预培养5d的愈伤组织分别用D600nm值为0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8的菌液浸泡10min，通过3次抗性筛选后，计算抗性愈伤率。

1.3数据处理

试验数据采用SPSS19.0和Excel2013软件进行统计分析。

2结果与分析

2.1不同继代次数对4种玉米材料抗性愈伤率的影响

分别将继代3、4、5、6、7次的HiⅡ、HiⅡB、HiⅡA、H99玉米幼胚诱导出来的愈伤组织用D600nm=0.5的农杆菌侵染，根据产生的抗性愈伤数作统计分析，详见表1。

由表1看出，继代3次的HiⅡ玉米对农杆菌最敏感，抗性愈伤组织率为31.25%；其次是HiⅡB，为26.56%；HiⅡA为24.45%，H99为10.26%。继代7次的抗性愈伤率均低于继代3、4、5、6次，其中H99的抗性愈伤率最低，仅为5.13%。

本试验结果显示：随着继代次数的增加，愈伤组织的转化效率逐渐降低，继代3次是农杆菌侵染的最佳时期。

2.2预培养时间对抗性愈伤转化率的影响

分别选取继代3次，预培养2、5、6、8、10d的愈伤进行侵染，通过3次抗性筛选后，其抗性愈伤率见表2。

由表2可以看出，侵染前愈伤组织的培养状态对玉米转化效率有很大的影响。HiⅡ、HiⅡB、HiⅡA、H99这4种玉米材料都以继代6d的抗性愈伤率最高，而继代2d的抗性愈伤率最低。HiⅡ、HiⅡB、HiⅡA、H99这4种玉米材料在新鲜继代培养基中预培养2d的抗性愈伤率分别为9.00%、10.00%、9.55%、4.29%；预培养2～6d，抗性愈伤率呈直线上升趋势，6d时达到最高值，4种材料以HiⅡ继代6d时的愈伤组织转化率最高，达到了27.70%，同期的HiⅡB、HiⅡA、H99分别为22.73%、21.43%、9.30%；6～10d时的抗性愈伤率有所降低，10d时最低，HiⅡ为15.94%，HiⅡB为12.38%，HiⅡA为11.91%，H99仅为4.76%。

2.3农杆菌浓度对抗性愈伤转化率的影响

用D600nm值分别为0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8的菌液侵染HiⅡ、HiⅡB、HiⅡA、H99玉米材料的愈伤组织10min，图1结果显示，农杆菌浓度在0.3～0.6之间时，转化率随着农杆菌浓度升高而增高，HiⅡ的转化率从9.00%升高到33.33%，HiⅡB的转化率从10.21%升高到23.62%，HiⅡA的转化率从8.11%升高到20.31%，H99的转化率从2.06%升高到7.35%；当农杆菌浓度大于0.6时，增加农杆菌的浓度，转化率反而下降，发生这样的结果可能是因为农杆菌浓度大时造成愈伤组织污染，使转化效率降低。综合比较可以看出，D600nm值为0.5～0.6是合适的浓度范围。

2.4抗性愈伤组织标记基因bar的PCR检测

在优化后的转基因体系中加入除草剂进行筛选，得到22块抗性愈伤组织，其中HiⅡ、HiⅡB、HiⅡA、H99玉米材料分别得到10、5、4、3块抗性愈伤组织，再通过标记基因bar的PCR检测分别得到5、2、2、1块阳性愈伤组织，标记基因大小为600bp，阳性率分别为50.00%、40.00%、50.00%，33.33%（图2）。综合比较可知，HiⅡ的阳性率相对较高。

2.5抗性愈伤再生植株的获得及bar基因试纸条检测

将PCR检测得到的阳性愈伤进行进一步扩繁，一部分进行出苗试验，另一部分进行保留，保留的目的是怕阳性愈伤在出苗过程中死亡。对于出苗的植株进行bar基因试纸条检测，目的是从蛋白质水平上进一步检测目的基因是否已经导入玉米基因组，结果从HiⅡ、HiⅡB、HiⅡA、H99玉米材料中分别获得4、1、2、1株阳性植株，其中HiⅡ的转基因效果最好（图3）。

2.6T0代转化植株目的基因的PCR鉴定

对PCR检测获得的10株转基因植株设计目的基因特异引物，经过PCR扩增出400bp的目的条带，检测到10株全为阳性植株（图4）。结果表明外源基因已经整合到玉米基因组中。

3讨论

对于农杆菌介导的玉米遗传转化，国内外报道大多数都是以幼胚作为遗传转化的受体[5]，但是幼胚的取材受时间影响很大，一旦错过了最佳时期就很难使试验继续进行。而愈伤组织不受时间影响，可以长期作为转化的受体，而且能长期继代培养。

玉米材料的不同对遗传转化有很大的影响，有的材料能诱导出适合转化的玉米材料，有的则不能。本试验用农杆菌转化继代3、4、5、6、7次的不同材料玉米愈伤组织，结果表明：HiⅡ的抗性愈伤率最高，其次是HiⅡB和HiⅡA，H99的最低，这与George等的研究结果[6-7]一致，即不同的玉米品种接受农杆菌侵染的能力也不同，接受转化的受体对品种的依赖性很强；基因型相同时，继代3次的抗性愈伤率高于其他继代次数，与余桂荣的试验结果相同；侵染前预培养愈伤组织的转化频率高于未预培养的，且预培养6d的侵染效果较好，这与伍晓丽等的研究结果[8]相一致。产生这些结果的原因可能有以下几点：（1）基因型方面，B73和A188是良好的转基因受体材料，HiⅡB和HiⅡA是B73与A188杂交得到的衍生系，HiⅡB诱导的愈伤组织较HiⅡA松散，HiⅡA外壳相对比较硬，HiⅡ是由HiⅡB与HiⅡA杂交所得到的，具有两者的综合优点，为Ⅱ型愈伤组织，Ⅱ型愈伤的生长速度非常快，形状类似菜花，结构松散，容易分化成苗[9]；而H99的愈伤组织大多为I型，外壳比较硬，不太容易扩大培养，抗性愈伤率比较低。（2）在愈伤组织的整个生长期间，前3次的生长比较快，细胞增殖能力强，3次以后由于代谢物质的逐渐积累，筛选出的抗性愈伤较低，因而继代3次的玉米愈伤组织侵染效率比较高。（3）侵染前预培养一段时间有利于愈伤的生理状态达到良好的状态，没有预培养的愈伤在上次继代到14d时，有可能会有少量的有毒物质产生，而预培养一段时间的愈伤组织代谢比较旺盛，适于农杆菌侵染。

农杆菌浓度对侵染效率也有很大的影响。农杆菌浓度过低时，吸附在细胞表面的农杆菌过少而不能有效地将T-DNA转移到植物体内，浓度过大时容易使愈伤组织污染。本研究表明，当菌液浓度为D600nm=0.5～0.6时，HiⅡ愈伤组织的抗性愈伤组织诱导率达最高值。

本试验通过优化后的转基因体系对4种玉米材料的愈伤组织进行侵染，在筛选过程中选择出抗性愈伤组织，取其抗性愈伤的一部分提取DNA，并对其进行PCR检测，对检测出来的抗性愈伤一分为二，一部分进行扩繁，另一部分进行再生出苗，再生出苗的植株进行bar基因试纸条的检测，进一步从蛋白质水平上对转基因结果进行检测，优化后的转基因体系极大地提高了转基因的转化率。

参考文献：

[1]RhodesCA，PierceDA，MettlerIJ，etal.Geneticallytransformedmaizeplantsfromprotoplasts[J].Science，1988，240（4849）：204-207.

[2]黄璐，卫志明.农杆菌介导的玉米遗传转化[J].实验生物学报，1999，32（4）：381-389.

[3]张荣，王国英，张晓红，等.根癌农杆菌介导的玉米遗传转化体系的建立[J].农业生物技术学报，2001，9（1）：45-48.

[4]王国英，张宏，谢友菊，等.玉米胚性愈伤组织转化及转Bt基因植株的抗虫性[J].农业生物技术学报，1995（3）：49-53.

[5]ZhaoZY，GuW，CaiT.MethodsforAgrobacterium-mediatedtransformation：UnitedStates，6822144[P].1999：598-840.

[6]GeorgeL，EapenS.Highfrequencyplant-regenerationthroughdirectshootdevelopmentandsomaticembryogenesisfromimmatureinflorescenceculturesoffingermillet（EleusinecoracanaGaertn）[J].Euphytica，1990，48（3）：269-274.

[7]MythiliPK，MadhaviA，ReddyVD，etal.Efficientregenerationofpearlmillet[Pennisetumglaucum（L.）R.Br.]fromshoottipcultures[J].IndianJournalofExperimentalBiology，2001，39（12）：1274-1279.

[8]伍晓丽，朱祯，李晚忱，等.农杆菌介导豇豆胰蛋白酶抑制剂基因（cpti）在玉米中的遗传转化[J].作物学报，2004（3）：297-298.

[9]季良越，孙晓丽，韦小敏，等.玉米胚性愈伤组织诱导和植株再生研究[J].河南农业大学学报，2002，36（2）：101-105.

2.4抗性愈伤组织标记基因bar的PCR检测

在优化后的转基因体系中加入除草剂进行筛选，得到22块抗性愈伤组织，其中HiⅡ、HiⅡB、HiⅡA、H99玉米材料分别得到10、5、4、3块抗性愈伤组织，再通过标记基因bar的PCR检测分别得到5、2、2、1块阳性愈伤组织，标记基因大小为600bp，阳性率分别为50.00%、40.00%、50.00%，33.33%（图2）。综合比较可知，HiⅡ的阳性率相对较高。

2.5抗性愈伤再生植株的获得及bar基因试纸条检测

将PCR检测得到的阳性愈伤进行进一步扩繁，一部分进行出苗试验，另一部分进行保留，保留的目的是怕阳性愈伤在出苗过程中死亡。对于出苗的植株进行bar基因试纸条检测，目的是从蛋白质水平上进一步检测目的基因是否已经导入玉米基因组，结果从HiⅡ、HiⅡB、HiⅡA、H99玉米材料中分别获得4、1、2、1株阳性植株，其中HiⅡ的转基因效果最好（图3）。

2.6T0代转化植株目的基因的PCR鉴定

对PCR检测获得的10株转基因植株设计目的基因特异引物，经过PCR扩增出400bp的目的条带，检测到10株全为阳性植株（图4）。结果表明外源基因已经整合到玉米基因组中。

3讨论

对于农杆菌介导的玉米遗传转化，国内外报道大多数都是以幼胚作为遗传转化的受体[5]，但是幼胚的取材受时间影响很大，一旦错过了最佳时期就很难使试验继续进行。而愈伤组织不受时间影响，可以长期作为转化的受体，而且能长期继代培养。

玉米材料的不同对遗传转化有很大的影响，有的材料能诱导出适合转化的玉米材料，有的则不能。本试验用农杆菌转化继代3、4、5、6、7次的不同材料玉米愈伤组织，结果表明：HiⅡ的抗性愈伤率最高，其次是HiⅡB和HiⅡA，H99的最低，这与George等的研究结果[6-7]一致，即不同的玉米品种接受农杆菌侵染的能力也不同，接受转化的受体对品种的依赖性很强；基因型相同时，继代3次的抗性愈伤率高于其他继代次数，与余桂荣的试验结果相同；侵染前预培养愈伤组织的转化频率高于未预培养的，且预培养6d的侵染效果较好，这与伍晓丽等的研究结果[8]相一致。产生这些结果的原因可能有以下几点：（1）基因型方面，B73和A188是良好的转基因受体材料，HiⅡB和HiⅡA是B73与A188杂交得到的衍生系，HiⅡB诱导的愈伤组织较HiⅡA松散，HiⅡA外壳相对比较硬，HiⅡ是由HiⅡB与HiⅡA杂交所得到的，具有两者的综合优点，为Ⅱ型愈伤组织，Ⅱ型愈伤的生长速度非常快，形状类似菜花，结构松散，容易分化成苗[9]；而H99的愈伤组织大多为I型，外壳比较硬，不太容易扩大培养，抗性愈伤率比较低。（2）在愈伤组织的整个生长期间，前3次的生长比较快，细胞增殖能力强，3次以后由于代谢物质的逐渐积累，筛选出的抗性愈伤较低，因而继代3次的玉米愈伤组织侵染效率比较高。（3）侵染前预培养一段时间有利于愈伤的生理状态达到良好的状态，没有预培养的愈伤在上次继代到14d时，有可能会有少量的有毒物质产生，而预培养一段时间的愈伤组织代谢比较旺盛，适于农杆菌侵染。

农杆菌浓度对侵染效率也有很大的影响。农杆菌浓度过低时，吸附在细胞表面的农杆菌过少而不能有效地将T-DNA转移到植物体内，浓度过大时容易使愈伤组织污染。本研究表明，当菌液浓度为D600nm=0.5～0.6时，HiⅡ愈伤组织的抗性愈伤组织诱导率达最高值。

本试验通过优化后的转基因体系对4种玉米材料的愈伤组织进行侵染，在筛选过程中选择出抗性愈伤组织，取其抗性愈伤的一部分提取DNA，并对其进行PCR检测，对检测出来的抗性愈伤一分为二，一部分进行扩繁，另一部分进行再生出苗，再生出苗的植株进行bar基因试纸条的检测，进一步从蛋白质水平上对转基因结果进行检测，优化后的转基因体系极大地提高了转基因的转化率。

参考文献：

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[7]MythiliPK，MadhaviA，ReddyVD，etal.Efficientregenerationofpearlmillet[Pennisetumglaucum（L.）R.Br.]fromshoottipcultures[J].IndianJournalofExperimentalBiology，2001，39（12）：1274-1279.

[8]伍晓丽，朱祯，李晚忱，等.农杆菌介导豇豆胰蛋白酶抑制剂基因（cpti）在玉米中的遗传转化[J].作物学报，2004（3）：297-298.

[9]季良越，孙晓丽，韦小敏，等.玉米胚性愈伤组织诱导和植株再生研究[J].河南农业大学学报，2002，36（2）：101-105.

2.4抗性愈伤组织标记基因bar的PCR检测

在优化后的转基因体系中加入除草剂进行筛选，得到22块抗性愈伤组织，其中HiⅡ、HiⅡB、HiⅡA、H99玉米材料分别得到10、5、4、3块抗性愈伤组织，再通过标记基因bar的PCR检测分别得到5、2、2、1块阳性愈伤组织，标记基因大小为600bp，阳性率分别为50.00%、40.00%、50.00%，33.33%（图2）。综合比较可知，HiⅡ的阳性率相对较高。

2.5抗性愈伤再生植株的获得及bar基因试纸条检测

将PCR检测得到的阳性愈伤进行进一步扩繁，一部分进行出苗试验，另一部分进行保留，保留的目的是怕阳性愈伤在出苗过程中死亡。对于出苗的植株进行bar基因试纸条检测，目的是从蛋白质水平上进一步检测目的基因是否已经导入玉米基因组，结果从HiⅡ、HiⅡB、HiⅡA、H99玉米材料中分别获得4、1、2、1株阳性植株，其中HiⅡ的转基因效果最好（图3）。

2.6T0代转化植株目的基因的PCR鉴定

对PCR检测获得的10株转基因植株设计目的基因特异引物，经过PCR扩增出400bp的目的条带，检测到10株全为阳性植株（图4）。结果表明外源基因已经整合到玉米基因组中。

3讨论

对于农杆菌介导的玉米遗传转化，国内外报道大多数都是以幼胚作为遗传转化的受体[5]，但是幼胚的取材受时间影响很大，一旦错过了最佳时期就很难使试验继续进行。而愈伤组织不受时间影响，可以长期作为转化的受体，而且能长期继代培养。

玉米材料的不同对遗传转化有很大的影响，有的材料能诱导出适合转化的玉米材料，有的则不能。本试验用农杆菌转化继代3、4、5、6、7次的不同材料玉米愈伤组织，结果表明：HiⅡ的抗性愈伤率最高，其次是HiⅡB和HiⅡA，H99的最低，这与George等的研究结果[6-7]一致，即不同的玉米品种接受农杆菌侵染的能力也不同，接受转化的受体对品种的依赖性很强；基因型相同时，继代3次的抗性愈伤率高于其他继代次数，与余桂荣的试验结果相同；侵染前预培养愈伤组织的转化频率高于未预培养的，且预培养6d的侵染效果较好，这与伍晓丽等的研究结果[8]相一致。产生这些结果的原因可能有以下几点：（1）基因型方面，B73和A188是良好的转基因受体材料，HiⅡB和HiⅡA是B73与A188杂交得到的衍生系，HiⅡB诱导的愈伤组织较HiⅡA松散，HiⅡA外壳相对比较硬，HiⅡ是由HiⅡB与HiⅡA杂交所得到的，具有两者的综合优点，为Ⅱ型愈伤组织，Ⅱ型愈伤的生长速度非常快，形状类似菜花，结构松散，容易分化成苗[9]；而H99的愈伤组织大多为I型，外壳比较硬，不太容易扩大培养，抗性愈伤率比较低。（2）在愈伤组织的整个生长期间，前3次的生长比较快，细胞增殖能力强，3次以后由于代谢物质的逐渐积累，筛选出的抗性愈伤较低，因而继代3次的玉米愈伤组织侵染效率比较高。（3）侵染前预培养一段时间有利于愈伤的生理状态达到良好的状态，没有预培养的愈伤在上次继代到14d时，有可能会有少量的有毒物质产生，而预培养一段时间的愈伤组织代谢比较旺盛，适于农杆菌侵染。

农杆菌浓度对侵染效率也有很大的影响。农杆菌浓度过低时，吸附在细胞表面的农杆菌过少而不能有效地将T-DNA转移到植物体内，浓度过大时容易使愈伤组织污染。本研究表明，当菌液浓度为D600nm=0.5～0.6时，HiⅡ愈伤组织的抗性愈伤组织诱导率达最高值。

本试验通过优化后的转基因体系对4种玉米材料的愈伤组织进行侵染，在筛选过程中选择出抗性愈伤组织，取其抗性愈伤的一部分提取DNA，并对其进行PCR检测，对检测出来的抗性愈伤一分为二，一部分进行扩繁，另一部分进行再生出苗，再生出苗的植株进行bar基因试纸条的检测，进一步从蛋白质水平上对转基因结果进行检测，优化后的转基因体系极大地提高了转基因的转化率。

参考文献：

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[3]张荣，王国英，张晓红，等.根癌农杆菌介导的玉米遗传转化体系的建立[J].农业生物技术学报，2001，9（1）：45-48.

[4]王国英，张宏，谢友菊，等.玉米胚性愈伤组织转化及转Bt基因植株的抗虫性[J].农业生物技术学报，1995（3）：49-53.

[5]ZhaoZY，GuW，CaiT.MethodsforAgrobacterium-mediatedtransformation：UnitedStates，6822144[P].1999：598-840.

[6]GeorgeL，EapenS.Highfrequencyplant-regenerationthroughdirectshootdevelopmentandsomaticembryogenesisfromimmatureinflorescenceculturesoffingermillet（EleusinecoracanaGaertn）[J].Euphytica，1990，48（3）：269-274.

[7]MythiliPK，MadhaviA，ReddyVD，etal.Efficientregenerationofpearlmillet[Pennisetumglaucum（L.）R.Br.]fromshoottipcultures[J].IndianJournalofExperimentalBiology，2001，39（12）：1274-1279.

[8]伍晓丽，朱祯，李晚忱，等.农杆菌介导豇豆胰蛋白酶抑制剂基因（cpti）在玉米中的遗传转化[J].作物学报，2004（3）：297-298.

[9]季良越，孙晓丽，韦小敏，等.玉米胚性愈伤组织诱导和植株再生研究[J].河南农业大学学报，2002，36（2）：101-105.