海沃德猕猴桃带芽茎段的组织培养快繁技术

于红梅+赵密珍+钱亚明+王静+夏谨+庞夫花

摘要：以海沃德猕猴桃带芽茎段为外植体直接诱导再生芽，对继代增殖和生根等培养基进行筛选试验，建立海沃德猕猴桃组织培养快繁技术。结果表明：75%乙醇30s+0.1%氯化汞8min为最佳消毒方法；诱导再生芽培养基为MS+1.0mg/L6-BA+0.1mg/LNAA；继代增殖培养基为MS+2.0mg/L6-BA+0.1mg/LNAA，其增殖系数为3.60；生根培养基为1/2MS+0.7mg/LIBA，生根率达100%，平均生根数达7.8条。

关键词：猕猴桃；带芽茎段；组织培养；快繁技术

中图分类号：S663.404+.3文献标志码：A文章编号：1002-1302（2014）11-0078-02

猕猴桃（Actinidiadelikiosa）是20世纪人工驯化栽培野生果树最有成就的四大果种之一[1]。海沃德猕猴桃是新西兰选育的美味猕猴桃优良品种，其果肉细嫩、香气浓郁、口感香甜清爽、具有丰富的营养价值和良好的药用价值，被称为“果中之王”。因其具有味美、耐贮、货架期长、较好的丰产性等优点而深受果农和广大消费者喜爱，从而成为世界主栽品种。目前，猕猴桃的常规育苗方法主要为实生苗的嫁接法和成年株的扦插繁殖法。嫁接苗童期生长缓慢，育苗周期长达2年以上，而扦插苗成活率低[2]。近年来，我国猕猴桃产业效益显著，栽培面积逐年扩大，传统育苗方法已不能满足规模化生产的需求，致使良种推广受到很大的限制。张海平等以其茎尖为外植体，经愈伤组织出芽建立快繁体系[2]。吴秀华等以无菌苗的叶片为外植体，采用一步出芽法对不定芽进行诱导、增殖和生根，从而成功建立离体快繁体系[3]。刘长春等以金富猕猴桃带芽茎段为外植体，诱导腋芽萌发芽，再通过增殖培养和生根建立了快繁体系[4]。隆前进等以红阳带芽茎段为外植体进行出芽诱导，通过不定芽增殖和生根成功建立离体快繁体系[5]。本试验在前人研究的基础上，以海沃德猕猴桃带芽茎段为外植体直接诱导再生芽，对继代增殖和生根等培养基等进行筛选试验，建立了海沃德猕猴桃组培快繁技术。

1材料与方法

1.1材料的选择

海沃德猕猴桃幼嫩新梢的带芽茎段采自江苏省农业科学院园艺研究所溧水基地，采集时间是2012年4月。

1.2消毒方法

将材料经流水冲洗1.5～2.0h，在无菌操净工作台上，取1.5cm带芽茎段先用75%医用乙醇消毒30s，接着无菌水冲洗2遍，然后按照以下处理要求分别进行消毒处理：A.0.1%氯化汞6min；B.0.1%氯化汞8min；C.0.1%氯化汞10min；D.10%次氯酸钠10min；E.10%次氯酸钠12min；F.10%次氯酸钠15min；G.10%双氧水5min；H.10%双氧水10min；I.10%双氧水15min，最后每个处理消毒后用无菌水冲洗4～5遍。

1.3筛选诱导再生芽培养基

灭菌后切取1.0cm带芽茎段，接入添加不同激素6-BA（0.5、1.0、2.0mg/L）和NAA浓度（0、0.1、0.2mg/L）组合的MS培养基，共8个处理。MS培养基蔗糖含量为30g/L、琼脂含量为6.5g/L，pH值为5.8～6.0。每个处理接种带芽茎段30个，置于温度（25±2）℃、光照强度约2400lx的条件下光照14～16h/d，15d后统计腋芽萌芽率。

1.4筛选继代增殖培养基

以MS为基本培养基，添加不同激素6-BA（0.5、1.0、2.0mg/L）和NAA浓度（0、0.1、0.2mg/L）组合，共9个处理。选取上述腋芽萌发长势一致的健壮海沃德猕猴桃再生芽，接入以上9种pH值为5.8～6.0的继代增殖培养基中，光照条件同“1.3”，培养20d后调查增殖效果及有效苗情况。

1.5筛选生根培养基

选取长势一致的健壮海沃德猕猴桃组培苗，接入生根培养基中，共11个处理，不同激素6-BA（0、0.5、0.7、1.0mg/L）和NAA（0、0.1、0.3mg/L）浓度组合配比，其他条件同上。每个处理转接30管，每管1株，培养12d后调查海沃德猕猴桃苗的生根率和平均生根数等。平均生根数=各处理所有根长大于0.5cm根的总数/30。

1.6炼苗移栽

打开生根试管苗保鲜膜，在室内放置1～2d，然后取出洗净培养基，移栽到配制好的基质里（进口泥炭∶珍珠岩∶蛭石的体积比为6∶3∶1），保持湿度90%左右，适当遮阴，保持通风，增加光照，3周后调查苗的成活率。

2结果与分析

2.1不同消毒剂的消毒效果

选用氯化汞、次氯酸钠、双氧水3种表面消毒剂分别对海沃德猕猴桃带芽茎段消毒处理不同时间，10d后调查消毒效果。结果表明：氯化汞消毒效果明显比次氯酸钠、双氧水好；次氯酸钠对外植体切口的损害较重，褐化多，双氧水对外植体消毒不彻底，污染、褐化较严重。处理B消毒效果最佳（表1）。

2.26-BA和NAA浓度配比对再生芽诱导的影响

由表2可知，添加NAA的基本培养基都可以萌芽，在0～2.0mg/L6-BA处理下，以1.0mg/L6-BA萌芽率最高，随6-BA浓度的增大，萌芽率略降低。NAA（0.1～0.2mg/L）处理的萌芽情况取决于6-BA浓度的配比，添加激素的最佳配比为1.0mg/L6-BA+0.1mg/LNAA，萌芽率达93.33%，其次为2.0mg/L6-BA+0.1mg/LNAA，萌芽率达86.67%。

2.36-BA和NAA浓度配比对继代增殖的影响

由表3可见，MS培养基中6-BA浓度为2mg/L的增殖系数为2.97～3.60，1.0mg/L的增殖系数为2.73～3.03，0.5mg/L的增殖系数为2.03～2.67，表明一定浓度范围内，6-BA浓度增加有利于芽的增殖，培养基中含NAA多少与芽增殖无线性关系，但NAA可促进生长。0.1mg/LNAA+2.0mg/L6-BA为海沃德猕猴桃最适的继代增殖配比浓度。

2.4不同激素对海沃德猕猴桃生根的影响

选取长势一致的健壮猕猴桃组培苗，接到不同激素浓度配比1/2MS培养基中进行生根对比，12d后调查生根情况，结果见表4。激素浓度配比对再生芽生根率的影响较明显，IBA浓度相同时，NAA浓度增加对根的伸长有抑制作用，纤细且短。IBA浓度为0.7mg/L时，不添加NAA，生根率达100%，且根粗壮、发达，平均生根数多达7.80条。

3小结

目前，利用现代生物技术进行组织离体再生培养已在植物的无性繁殖中广泛应用。培养基中的不同激素浓度配比对猕猴桃诱导愈伤组织、继代增殖、生根均有很大的影响[6-7]。本试验在前人研究的基础上缩小6-BA、NAA和IBA激素的浓度配比梯度，建立海沃德猕猴桃带芽茎段的组织培养快繁技术。尝试应用海沃德猕猴桃带芽茎段跳过愈伤组织诱导不定芽，直接诱导腋芽萌发再生芽，植株整齐生长快，其再生芽萌发率达到100%。在继代增殖过程中，合理使用6-BA、NAA配比浓度，增殖系数达到3.60，低于吴秀华等的“海沃德平均繁殖系数为6.38”的结果[3]，但本试验有效苗率达89.26%，提高了再生芽品质。在生根过程中，不定根的生根率达100%，明显高于张海平等的“海沃德猕猴桃中获得的生根率为90.0%”的结果[2]，与吴秀华等的海沃德猕猴桃生根率试验结果[3]相同。在海沃德猕猴桃移栽时，平均生根数直接影响组培苗的移栽存活率，张海平等指出选用进口泥炭的成活率达95%，吴秀华等证明普通基质移栽成活率92.38%[3]，而本试验在通气性较好的进口泥炭、珍珠岩、蛭石混合基质中，根系能够得到良好发育，移栽成活率达到96.7%，本试验生根时间缩短至12d，同时跳过愈伤组织诱导不定芽，快繁周期大为缩短，利于生产上规模化快速繁育种苗。

参考文献：

[1]Warring，tonIJ，WestonGC.Kiwifruits：scienceandmanagement[M].Auckland：RayRichardsPublisher，1990.

[2]张海平，周建峰，任目瑾.海沃德猕猴桃组织培养快速繁育技术研究[J].陕西林业科技，2011（2）：8-11.

[3]吴秀华，张艳玲，周月，等.‘海沃德猕猴桃叶片高频直接再生体系的建立[J].植物生理学报2013，49（8）：759-763

[4]刘长春，陈泽雄，龚雪芹，等.金富猕猴桃离体培养与植株再生的优化研究[J].西南师范大学学报：自然科学版，2007，32（5）：124-128.

[5]隆前进，吴延军，谢鸣.‘红阳猕猴桃叶片和带芽茎段的组织培养快繁技术[J].浙江农业学报，2010（4）：429-432

[6]姜维梅，李凤玉.大籽猕猴桃离体再生系统的建立[J].浙江大学学报：农业与生命科学版，200329（3）：295-299.

[7]刘长江，刘国成，赵德英，等.野生软枣猕猴桃茎尖培养研究[J].中国果树，2009（2）：32-34.

2.4不同激素对海沃德猕猴桃生根的影响

选取长势一致的健壮猕猴桃组培苗，接到不同激素浓度配比1/2MS培养基中进行生根对比，12d后调查生根情况，结果见表4。激素浓度配比对再生芽生根率的影响较明显，IBA浓度相同时，NAA浓度增加对根的伸长有抑制作用，纤细且短。IBA浓度为0.7mg/L时，不添加NAA，生根率达100%，且根粗壮、发达，平均生根数多达7.80条。

3小结

目前，利用现代生物技术进行组织离体再生培养已在植物的无性繁殖中广泛应用。培养基中的不同激素浓度配比对猕猴桃诱导愈伤组织、继代增殖、生根均有很大的影响[6-7]。本试验在前人研究的基础上缩小6-BA、NAA和IBA激素的浓度配比梯度，建立海沃德猕猴桃带芽茎段的组织培养快繁技术。尝试应用海沃德猕猴桃带芽茎段跳过愈伤组织诱导不定芽，直接诱导腋芽萌发再生芽，植株整齐生长快，其再生芽萌发率达到100%。在继代增殖过程中，合理使用6-BA、NAA配比浓度，增殖系数达到3.60，低于吴秀华等的“海沃德平均繁殖系数为6.38”的结果[3]，但本试验有效苗率达89.26%，提高了再生芽品质。在生根过程中，不定根的生根率达100%，明显高于张海平等的“海沃德猕猴桃中获得的生根率为90.0%”的结果[2]，与吴秀华等的海沃德猕猴桃生根率试验结果[3]相同。在海沃德猕猴桃移栽时，平均生根数直接影响组培苗的移栽存活率，张海平等指出选用进口泥炭的成活率达95%，吴秀华等证明普通基质移栽成活率92.38%[3]，而本试验在通气性较好的进口泥炭、珍珠岩、蛭石混合基质中，根系能够得到良好发育，移栽成活率达到96.7%，本试验生根时间缩短至12d，同时跳过愈伤组织诱导不定芽，快繁周期大为缩短，利于生产上规模化快速繁育种苗。

参考文献：

[1]Warring，tonIJ，WestonGC.Kiwifruits：scienceandmanagement[M].Auckland：RayRichardsPublisher，1990.

[2]张海平，周建峰，任目瑾.海沃德猕猴桃组织培养快速繁育技术研究[J].陕西林业科技，2011（2）：8-11.

[3]吴秀华，张艳玲，周月，等.‘海沃德猕猴桃叶片高频直接再生体系的建立[J].植物生理学报2013，49（8）：759-763

[4]刘长春，陈泽雄，龚雪芹，等.金富猕猴桃离体培养与植株再生的优化研究[J].西南师范大学学报：自然科学版，2007，32（5）：124-128.

[5]隆前进，吴延军，谢鸣.‘红阳猕猴桃叶片和带芽茎段的组织培养快繁技术[J].浙江农业学报，2010（4）：429-432

[6]姜维梅，李凤玉.大籽猕猴桃离体再生系统的建立[J].浙江大学学报：农业与生命科学版，200329（3）：295-299.

[7]刘长江，刘国成，赵德英，等.野生软枣猕猴桃茎尖培养研究[J].中国果树，2009（2）：32-34.

2.4不同激素对海沃德猕猴桃生根的影响

选取长势一致的健壮猕猴桃组培苗，接到不同激素浓度配比1/2MS培养基中进行生根对比，12d后调查生根情况，结果见表4。激素浓度配比对再生芽生根率的影响较明显，IBA浓度相同时，NAA浓度增加对根的伸长有抑制作用，纤细且短。IBA浓度为0.7mg/L时，不添加NAA，生根率达100%，且根粗壮、发达，平均生根数多达7.80条。

3小结

目前，利用现代生物技术进行组织离体再生培养已在植物的无性繁殖中广泛应用。培养基中的不同激素浓度配比对猕猴桃诱导愈伤组织、继代增殖、生根均有很大的影响[6-7]。本试验在前人研究的基础上缩小6-BA、NAA和IBA激素的浓度配比梯度，建立海沃德猕猴桃带芽茎段的组织培养快繁技术。尝试应用海沃德猕猴桃带芽茎段跳过愈伤组织诱导不定芽，直接诱导腋芽萌发再生芽，植株整齐生长快，其再生芽萌发率达到100%。在继代增殖过程中，合理使用6-BA、NAA配比浓度，增殖系数达到3.60，低于吴秀华等的“海沃德平均繁殖系数为6.38”的结果[3]，但本试验有效苗率达89.26%，提高了再生芽品质。在生根过程中，不定根的生根率达100%，明显高于张海平等的“海沃德猕猴桃中获得的生根率为90.0%”的结果[2]，与吴秀华等的海沃德猕猴桃生根率试验结果[3]相同。在海沃德猕猴桃移栽时，平均生根数直接影响组培苗的移栽存活率，张海平等指出选用进口泥炭的成活率达95%，吴秀华等证明普通基质移栽成活率92.38%[3]，而本试验在通气性较好的进口泥炭、珍珠岩、蛭石混合基质中，根系能够得到良好发育，移栽成活率达到96.7%，本试验生根时间缩短至12d，同时跳过愈伤组织诱导不定芽，快繁周期大为缩短，利于生产上规模化快速繁育种苗。

参考文献：

[1]Warring，tonIJ，WestonGC.Kiwifruits：scienceandmanagement[M].Auckland：RayRichardsPublisher，1990.

[2]张海平，周建峰，任目瑾.海沃德猕猴桃组织培养快速繁育技术研究[J].陕西林业科技，2011（2）：8-11.

[3]吴秀华，张艳玲，周月，等.‘海沃德猕猴桃叶片高频直接再生体系的建立[J].植物生理学报2013，49（8）：759-763

[4]刘长春，陈泽雄，龚雪芹，等.金富猕猴桃离体培养与植株再生的优化研究[J].西南师范大学学报：自然科学版，2007，32（5）：124-128.

[5]隆前进，吴延军，谢鸣.‘红阳猕猴桃叶片和带芽茎段的组织培养快繁技术[J].浙江农业学报，2010（4）：429-432

[6]姜维梅，李凤玉.大籽猕猴桃离体再生系统的建立[J].浙江大学学报：农业与生命科学版，200329（3）：295-299.

[7]刘长江，刘国成，赵德英，等.野生软枣猕猴桃茎尖培养研究[J].中国果树，2009（2）：32-34.