中枢神经损伤后轴突变性的研究进展

王振宇

中枢神经损伤后轴突变性的研究进展

王振宇

轴突变性是神经损伤后病理变化的主要特征之一，但轴突变性不仅存在于神经系统外伤中，还广泛存在于神经系统变性疾病和慢性炎症疾病的过程中[1-3]。既往对神经损伤后的研究主要集中于神经元的病理改变，损伤后神经可塑性和神经再生也主要从神经元的角度进行研究，通过给予神经营养因子、去除胶质瘢痕、运用组织工程支架、移植相关细胞等手段促进胞体的生长[4-6]，而对轴突变性的研究较少，并且近几年研究发现，轴突变性和胞体死亡可能拥有独立的机制。本文就中枢神经损伤后轴突变性的研究进展进行综述。

一、轴突变性组织学层面的变化及分类

轴突变性可以有轴突连续性的中断，也可以无连续性的变化。轴突变性的方向包括向胞体远端的顺行性变性和向胞体近端的逆行性变性。根据轴突开始变性的时间节点又可以分为急性变性和慢性变性。

1.急性轴突变性：急性轴突变性是指中枢神经损伤后几个小时内发生的快速轴突崩解，它主要发生在轴突损伤处近 、远 侧 300～400 μm 的 范 围 内[7]。 Kerschensteiner 等[7]和Knoferle 等[8]分别描述了 脊 髓 和 视 神 经中的急性轴突变 性 。该类型变性速度在不同模型和不同器官是不同的，比如小鼠脊髓中轴突的急性变性速度比视神经中的快。但基本的病理变化是类似的：(1)在损伤后起始的 10～30min 内，轴突的宏观形态是没有改变的；(2)30m in后轴突的超微结构出现了可以观察到的变化，这主要包括神经细丝的聚合和错位，以及后续微管的破碎[9]；(3)此外，线粒体和囊泡等细胞器在局部聚集，提示轴浆运输可能受到了损害；(4)急性变性的另一个超微结构的特 征是自 噬过程的激活[10]；损伤 后 6 h 后 可以发现轴突内自噬体数量的明显增加；(5)外周神经在损伤 24 h后即可有神经出芽的发生，但该再生缺乏适当的方向性[7]。

2.沃勒变性：沃勒变性通常是指远离损伤部位的轴突变性。这些部位没有受到急性轴突变性的影响，损伤24～72 h后仍保持了形态的稳定，但接下来仍会产生类似急性变性的变化。沃勒变性的速度和方向是差异较大的。在体外培养的原代神经元细胞中，沃勒变性的速度大约为 0.4mm/h[11]；在小鼠坐骨神经中速度大约为 24mm/h[12]。在外周神经横断性损伤中，沃勒变性是顺行性发生的，而在外周神经挤压性损伤中，沃勒变性却是逆向发生的，由损伤部位的远侧端向损伤部分发生。

3.慢性轴突变性：慢性轴突变性更为复杂，有多种形态改变，包括“逆行性变性”和轴突肥大。“逆行性变性”可能由突触连接障碍和/或轴突远端变性启动，由损伤的远侧端向近侧端发生类似沃勒变性的改变[13-14]。轴突肥大时可见聚集的异形线粒体和其他细胞器，并且伴随着轴浆运输的损害，轴突肥大后期也会导致类似沃勒变性的轴突瓦解[15]。

二、轴突变性的细胞学层面的变化

轴突变性时，细胞学层面也发生了复杂的变化，但轴突变性的基本病理过程均可归纳为轴突膜通透性增强、线粒体功能障碍及轴浆运输障碍3类。

1.轴突膜通透性增强：轴突膜是维持轴突完整性以及正常功能的重要保证，各种损伤后可以改变轴突膜的通透性，引起轴突内钙离子和钠离子病理性的增高。钙离子可以通过破损的轴突膜、激活的钙离子介导的钙内流和轴突内钙库的释放等方式进入轴突膜内[16]。异常的钙库操纵性钙内流(SOCE)可能参与弥散性轴索损伤早期神经元的钙超载，这个过程是通过增强一种重要的内质网钙离子感受器STIM 1的表达来实现的[17]。

钙离子的增加后续又激活了钙依赖性的蛋白酶的活化，比如钙蛋白酶(Calpain)。Calpain 是中枢神经内广泛分布的Ca2+依赖的半胱氨酸蛋白酶，细胞内增高的 Ca2+可以增加Calpain 的活性，并且引起其下游细胞骨架及膜蛋白降解[18]。中枢神经系统内，Calpain 的底物很多，因此 Calpain 参与了细胞的多种功能的完成。Calpain 在沃勒变性中介导了轴突和突触的退变[19]。

2.线粒体功能障碍：线粒体供给轴突以能量，维持轴突的正常功能。轴突损伤后线粒体的功能改变、运输障碍和凋亡反应的激活均会影响轴突的功能障碍[20]。研究人员还发现在弥散性轴索损伤的动物模型中，钙离子的内流和 calpain的激活并不是在轴突的所有部位均出现，而是和线粒体的聚集部位明显相关[21]，这种局部的线粒体聚集也许是由于细胞骨架的破坏和其他细胞器的阻挡。

3.轴浆运输障碍：由于轴突末端距离神经胞体非常远，所以轴浆运输在维持轴突的正常结构和功能中十分重要。轴浆运输主要由2类蛋白介导，驱动蛋白推动轴浆的快速顺向运输，动力蛋白推动轴浆的快速逆向运输[22]。已有证据表明，小鼠在驱动蛋白超家族成员KIF1Bβ上的突变会导致对突触囊泡的运输障碍，进而导致渐进性的肌力下降等神经病的发生[23]；动力蛋白重链的突变会导致杂合小鼠的运动神经元和轴突变性[24]。

三、轴突变性的特异机制

既往认为轴突变性和年龄及神经元胞体有直接关系，但后续的研究发现逐个否定了先前的看法。轴突的再生和年龄是由不同的机制控制的：daf-2/insulin 受体和 daf-18/PTEN-mTOR 通路皆调控动物的生命长度，daf-2/insulin 受体通过daf-16/FOXO-DLK 通路调控年龄依赖性的神经轴突再生，但 daf-18/PTEN-mTOR 通路却可以在成年和老年动物身上都实现神经再生的调控[25]。

而Wlds突变小鼠的发现更是不仅否定了轴突变性依赖神经元的观点，而且为研究轴突变性的特异机制打开了一扇窗。Lumn 等[26]在 1989 年发现，Wlds突变小鼠周围神经切断1～2周后损伤远侧段轴突并不发生变性，而正常野生型小鼠典 型 的 沃 勒变性常发生于轴突切断后 2～3 d。 将 Wlds突变小鼠的神经纤维移植到野生型小鼠体内，其轴突的变性速度和在 Wlds突变小鼠体内的速度一致。此外，Wright等[27]还发现 Wlds小鼠的轴突保护作用和其基 因剂量 呈现正 相关。Wlds编码的融合蛋白由 N 端 70 个氨基酸的泛素因子 E4B (UBE4B)的片段、C 段尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)合成酶尼克酰胺转移酶 1(Nmnat1)及中间 的 18 个氨基酸共同组成[28]。Wlds突变基因可以明显减慢轴突的变性速度。正常的野生型小鼠体内轴突切断后数小时即刻开始发生沃勒变性，而 Wlds突变小鼠切断轴突远端的轴索可以在同样的损伤后的数月内维持结构完整，甚至晚于所连接的胞体开始变性的时间。Wlds编码的融合蛋白对轴突的保护作用在各个物种间广泛存在，在果蝇和啮齿类动物中均显示了类似的作用。Wlds编码的融合蛋白在果蝇中为 dNmnat，在哺乳类动物中为Nmnat2。

Fang 等[29]发明了一种新型的易观察的轴突损伤模型，他们通过果蝇的 Gal4-UAS 系统表达绿色荧光蛋白，而该荧光蛋白受 dprpGaw-Gal4 驱动子的调控，并可以由果蝇翅上的感觉神经元表达出现。观察轴突变性时，研究人员就仅仅观察果蝇翅上的荧光蛋白表达就可以了。Avery 等[30]发现核外的dNmnat蛋白主要存在于线粒体上，即使在轴突没有损伤的情况下，dNmnat高表达的轴突中线粒体的数量和体积虽然和低表达轴突中的类似，但是活跃的线粒体明显更多。Fang 等[29]发现和 dNmnat低表达的轴突相比，dNmnat高表达的轴突中线粒体明显增多，提示轴突的长期生存可能和内部线粒体的存在数量有关。进一步研究，干扰线粒体顺行轴浆运输需要 的 连接蛋白 M ilton，轴突中线 粒体明显减 少，并且该现象不能被再次高表达的dNmnat所改变。但作者没有进一步区分，干扰 M ilton 后轴浆运输中的其他细胞器和物质是否也受到了干扰。这表明轴突变性的关键环节应该在线粒体 上 。 后 续 Kitay 等[31]又 发 现 在 果 蝇 的 运 动 神 经 中 ，干 扰M ilton 后并不引起轴突的快速变形。所以感觉、运动神经的变性机制也许还存在着差异。Wishart等[32]发现 Wlds表达引起的下游各种变化集中于细胞周期的改变，轴突的易损伤性和有丝分裂后及终末分化的神经元修饰的细胞周期通路有密切关系。另外，Wlds的表达诱导了细胞周期相关基因的增加，比如，NAD 依赖基因和 Pttg1-依赖基因，但 Wlds没有改变细胞的增殖速度。

但 Wlds也许并不是轴突变性的唯一机制。比如，Wlds并不削弱 SOD1-介导的运动神经元病[33]，并且观察到突触前末梢内线粒体和突触囊泡的聚集，也许逆行轴浆运输的障碍是SOD1-介导的神经损伤的一个原因。此外，还有其他学者从另外的角度对轴突变性的机制进行了研究。Zhu 等[34]研究了 Wlds突变小鼠，该小鼠在中枢和外周神经有明显的神经变性，并存在渐进性的共济失调表现。Zhu 等[34]发现 Wlds突变小鼠的轴突变性是由 Wlds和 Bax蛋白突变调控的，Atp8a2是责任基因。Atp8a2广泛存在于脑部、脊髓以及视网膜中，拥有磷脂酰丝氨酸移位酶活性。突变的Atp8a2 丧失了这种活性，导致了轴突变性。

四、轴突变性的无创性观察

轴突变性历史上是通过病理切片和染色诊断的，包括常规的 HE 染色，还有特殊的银染色、Palmgren 染色技术等[35]。现在更多的病理诊断是通过免疫组织化学的方法来诊断了。免疫组织化学的方法中通常选取轴浆运输中蛋白的抗体来实现，最常用的淀粉样前蛋白[36]。淀粉样前蛋白通过轴浆顺行运输在轴突中移动，任何对轴突的干扰和破坏，会导致该蛋白动力学的异常及局部的肿胀，这可以通过免疫组织化学的方法明显的显示出来。免疫组织化学技术已经成为诊断轴突变性的金标准。

但病理诊断是侵入性检查，仅仅在实验或者尸检中应用，临床价值有限。所以这种现实促使了对轴突损伤非侵袭性 检 查 的 研 究 。 弥 散 性 张 力 成 像(diffusion tensor imaging，DTI)是较为有前景的一项技术[37]。在轻度轴索损伤的患者中，DTI也可以发现白质的异常，包括各向异性分数及其他DTI相关的指标的变化。Qin 等[38]通过平均扩散系数、各向异性分数、横向特征值等建立扩散指数，认为可以和病理改变 相 关 起 来 。 此 外 ，Greer 等[39]在 轻 微 弥 散 性 轴 索 损 伤(diffuseaxonal injury，DAI)小鼠的离断和未离断轴突的神经胞体上均检测到了电生理的异常。脑干微波的逐步消失或者延迟以及听觉诱发电位的中度延迟被认为是鉴别轴突亚临床损伤的方法。还有一些学者在轴突损伤相关的血液学指标的研究方面进行了尝试，并且取得了一些线索。一些研究发现aII血影蛋白降解产物SBDP150和145与急性神经元凋亡有关，SBDP120 与细胞的死亡瀑布反应有关[40]。

五、轴突变性的复杂性

除了上述归纳的较为重要的机制以外，很多病理变化参与了轴突变性的发生和发展。例如，磷酸酶和张力蛋白同源基因(PTEN 基因)是一抑癌基因，敲除 PTEN 后可以促进轴突的生长，通过短发夹样RNA外源性抑制PTEN也可以促进轴突生长；氧压力和前炎性细胞因子可以导致神经轴突的变性；维生素E缺乏可以导致小鼠海马神经元的轴突变性。

并且，即使仅仅考虑上述重要的机制，它们之间也是互相联系的。有研究发现野生型动物轴突损伤后存在 Ca2+峰，但 dNmnat高表达的轴突内 Ca2+峰明显减小，并且 dNmnat高表达轴突内的线粒体结合 Ca2+的能力也比野生型的高，可以减弱 Ca2+峰的产生。

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2014-11-27)

(本文编辑：张丽)

10.3877/cma.j.issn.2095-9141.2015.01.014

100191 北京，北京大学第三医院神经外科

王振宇，Email：wangzhenyu@163.com

王振宇 .中枢神经损伤后轴突变性的研究进展[J/CD].中华神经创伤外科电子杂志,2015,1(1):49-52.