骨髓间充质干细胞调控肝星状细胞治疗肝纤维化机制的研究进展

陈玲肖（综述）　宋水川　马炬明（审校）

·综述·

骨髓间充质干细胞调控肝星状细胞治疗肝纤维化机制的研究进展

陈玲肖（综述）宋水川马炬明（审校）

肝纤维化不是一个独立的疾病，是各种致病因子导致肝内结缔组织的异常增生，引起肝内弥漫性细胞外基质（ECM）过度沉积的病理过程，较多慢性肝脏疾病均可引起肝纤维化。常规的内科保肝治疗效果不佳，病死率较高。目前原位肝移植仍是治疗终末期肝病最有效的措施，但由于缺乏供体、费用昂贵、并发症多、免疫排斥等因素，使这一治疗方法较难得到推广。骨髓间充质干细胞（BMSCs）具有多向分化的潜能，多项研究表明，BMSCs能有效逆转肝纤维化，对肝组织的损伤和修复有显著作用。

1　骨髓间充质干细胞的特性及鉴定

目前认为，BMSCs治疗肝纤维化的可能机制是：（1）促进正常肝细胞再生。（2）BMSCs抑制肝星状细胞（HSCs）的活化并促使其凋亡。（3）BMSCs分泌的细胞因子/生长因子的作用。（4）BMSCs促进ECM的降解作用。（5）BMSCs激活并分化成肝卵原细胞，促肝细胞再生。HSCs的活化和增殖是肝纤维化发生、发展的中心环节［1］。控制HSCs的激活和增殖以逆转肝纤维化的进程是抗肝纤维化研究的重点之一。

BMSCs是具有高度自我更新能力和多向分化潜能的成体干细胞。在适当的条件下，源于中胚层的骨髓间充质干细胞可以跨越胚层向内胚层及外胚层的组织、细胞分化，比如分化为肝细胞、胆管上皮细胞、内皮细胞、骨骼肌细胞、心肌细胞、神经元细胞和视网膜细胞等［2，3］。研究者称之为“可塑性”或“横向分化”。

到目前为止，BMSCs无特定的表面标志物。研究发现，BMSCs能 够 表 达CD105（SH2）、CD73（SH3/4）、CD44、CD90（Thy-1）、CD71、CD106等，但不表达造血干细胞的标志如CD45，CD34，CD14，和CD11，也不表达共刺激分子CD80，CD86，和CD40［4］。另外BMSCs还能分泌多种细胞因子及受体、趋化因子、粘附分子等。为规范MSCs的研究，2006年国际细胞移植治疗学会在其官方期刊 Cytotherapy上对MSCs的鉴定提出了三条基本标准［5］：首先在体外正常培养条件下能够快速贴附到塑料培养皿底；其次细胞表面标志组合为CD14-CD11b-CD19-CD79α-CD34-CD45-HLA-DR-CD73+CD90+CD105+；再次可以向中胚层方向成骨、脂肪和软骨诱导分化。

2　肝星状细胞致肝纤维化发生的细胞分子机制

肝纤维化发生、发展的直接原因是肝脏受到长期反复刺激，导致肝纤维化的主要成分-细胞外基质（ECM）合成过多，降解减少，堆积增加。目前，国内外主流观点认为，HSCs是受损肝脏中过多ECM的主要来源。控制HSCs的激活和增殖以逆转肝纤维化的进程是抗肝纤维化研究的重点之一。

HSCs位于肝窦Disse间隙，约占肝脏细胞总数的13%，与肝细胞及肝窦内皮细胞直接接触。HSCs正常情况下处于静息状态，主要功能是参与维生素A的代谢和储存脂肪。其最大的形态学特征主要表现为不规则的形态，胞体可呈不规则多边形，卵圆形或星形，胞体通常延伸出各种不同形状的胞突包绕于肝血窦，邻近的HSCs主要也是由延伸出来的胞突相接触联系［6］。1985年Friedman等首次报道这种贮脂细胞是生成胶原的主要细胞，之后大量研究开始关注其在肝纤维化进程中的作用，并取较很大进展，调控HSCs活化的关键信号通路基本阐明。

研究发现，在病毒、酒精等慢性损伤因素作用下，肝细胞、窦内皮细胞、Kupffer细胞、炎症细胞等通过旁分泌途径，激活的HSCs也可通过自分泌途径，产生TGF-β1、血小板衍生生长因子（PDGF）等多种细胞因子，使静止的HSCs被激活，转变成肌成纤维细胞样细胞，表达α-平滑肌动蛋白（α-SMA）。此时，肝星状细胞大量增殖，凋亡减少，合成大量ECM，同时ECM降解减少，以致其在肝内大量沉积，肝纤维化逐渐形成。

3　骨髓间充质干细胞调控肝星状细胞治疗肝纤维化的机制

3.1骨髓间充质干细胞抑制肝星状细胞的活化并促使其凋亡 HSCs是正常肝和纤维化时合成细胞外基质的主要细胞，HSCs的过度激活导致肝纤维化的发生。近来不断有研究发现，BMSCs与HSCs体外联合培养后，BMSCs可以抑制HSCs的活化，并促进其凋亡，减少细胞外基质的沉积，从而缓解肝纤维化。

赵东长等［7］利用建立BMSCs与HSCs非直接接触的联合培养体系进行联合培养，结果显示HSCs的增殖及α-SMA的表达均较对照组明显减少，表明BMSCs可以显著抑制HSCs的活化及增殖。Su SB等［8］研究表明，体外HSCs与MSCs联合培养24 h后，与对照组比较，HSCs表现明显增殖抑制，且呈现时间依赖性。MSCs可阻滞HSCs由G0/G1期向S期转换，使G0/G1期细胞增多，S期细胞减少，抑制HSCs的增殖并促进其凋亡。Parekkadan等［9］通过细胞联合培养发现BMSCs可以使HSCs细胞周期停滞于G0/G1期， 从而抑制HSCs生长， 促进活化状态的HSCs凋亡，同时减少联合培养体系中胶原的沉积。杨文等［10］发现在BMSCs与HSCs联合培养组中，随着培养的时间延长，BMSCs对HSCs的促凋亡作用越来越明显，呈时间依赖性增加，用SYBR荧光实时定量RT-PCR法检测死亡受体5mRNA的表达，发现随着联合培养时间的延长，联合培养组中HSCs的死亡受体5mRNA合成呈递增趋势，较对照组显著增多，进而推断BMSCs能促进HSCs的凋亡，上调死亡受体5mRNA的表达。Lin N等［11］通过将BMSCs经尾静脉注射入CCl4诱导的大鼠肝纤维化模型中，发现BMSCs在体内也能够促进HSCs发生凋亡。

3.2骨髓间充质干细胞通过旁分泌机制和信号通路传导作用于HSCs 骨髓间充质干细胞能分泌多种细胞因子， 如肝细胞生长因子（HGF）、神经细胞生长因子（NGF）、胰岛素样生长因子1（IGF-1）、转化生长因子（TGF）和白介素、干细胞因子等。最近的相关研究表明，BMSCs主要是通过旁分泌某些细胞因子和信号通路传导作用于HSCs。

Parekkadan 等［9］通过细胞共同培养方法，发现BMSCs可分泌白介素-10（IL-10）、TNF-α和HGF，通过旁分泌方式抑制HSCs增殖和胶原合成，促进活化状态的HSCs凋亡。中和IL-10和TNF-α能阻断BMSCs的抑制HSCs增殖和胶原合成的作用；中和HGF能阻断BMSCs的促HSCs凋亡的作用。同时活化的HSCs可分泌IL-6促进BMSCs IL-10的分泌。Chen GZ等［12］采用将鼠MSCs与HSCs非接触共同培养的方法，证实MSCs可以不通过直接接触而对HSCs的激活产生抑制作用，应用酶联免疫吸附法（ELISA）检测MSCs与HSCs联合培养的上清液中HGF的浓度上升。将c-met多克隆抗体预先封闭HSCs表面的c-met受体，再与MSCs联合培养，结果显示MSCs失去对HSCs的上述作用，由此看出MSCs抑制HSCs的活化、增殖，促进HSCs的凋亡可能是通过旁分泌HGF，经HGF/c-met途径发挥作用的。史立君等［13］研究发现BMSC可分泌NGF、HGF、TGF-β等细胞因子，而活化的HSCs能够表达NGF受体p75，NGF与p75结合后促进了HSCs的凋亡，其可能的途径是NF-KB和JNK途径，即NGF与p75结合后激活JNK，阻断ERK的磷酸化，同时抑制NF-KB的活化，从而起到抑制HSCs增殖，促进HSCs凋亡的作用。张君红等［14］通过建立BMSCs与HSCs细胞联合培养体系，发现HSCs中死亡受体5、caspase-8mRNA及蛋白的表达较对照组均明显增高。用慢病毒介导的Sh-RNA将BMSCs中的HGF基因沉默后观察蛋白的表达及凋亡的变化，发现HGF-ShRNA干扰组中的凋亡率及两种蛋白的表达较联合培养组低，但高于对照组，表明BMSCs旁分泌的HGF能上调HSCs中死亡受体5及caspase-8的表达，促进HSCs的凋亡，可能是BMSCs抗肝纤维化作用的分子机制之一，在该联合培养体系中，尚有其他许多因子与HSCs的凋亡有关。

4　小结与展望

BMSCs为肝纤维化的治疗方面开辟了一个新的领域。且BMSCs具有易采集，能体外大量扩增，可自我更新并向多种细胞类型分化，体积较小利于进入肝实质区，自体移植而无免疫排斥，不涉及伦理道德问题等被认为是最具治疗潜力的供体细胞［15］。

虽然BMSCs在治疗肝纤维化方面有较多的实验研究，但广泛应用于临床尚存在一系列问题。首先，BMSCs治疗肝纤维化的具体机制还不甚明确。BMSCs对HSCs活化、增殖以及凋亡等调控作用目前主要还停留在体外细胞相互作用的研究上，而对于移植入体内的BMSCs改善肝脏纤维化状态是否也通过调控HSCs活性以及如何调控等问题，有待进一步研究。其次，BMSCs治疗肝纤维化的效果尚未确定，甚至可能加重肝纤维化的形成。Carvalho等［16］用MSCs治疗严重肝损害模型的大鼠并与对照组相比较，结果未发现肝功能明显改善。而DiBonzo等［17］认为，只有极少量MSCs分化成肝细胞样细胞，且MSCs移植后会出现相当数量的成肌纤维样细胞，而这些成肌纤维样细胞正是引起纤维化基质沉积的主要细胞来源。有研究表明，BMSCs移植的首要潜在危险因素是其在体外表现为抗癌作用， 而在体内却会促进肿瘤细胞的生长；BMSCs体内数量少，体外分离、纯化及扩增方法还不够完善。

1Friedman SL. Hepatic stellate cells： protean， multifunctional， and enigmatic cells of the liver. Physiol Rev，2008，88（1）：125～172.

2Terai S，Sakaida I，Yamamoto N，et al. An in vivo model for monitoring trans-differentiation of bone marrow cells into functional hepatocytes. J Biochem. 2003，134（4）：551～558.

3Neuhuber B， Gallo G， Howard L， et al. Reevaluation of in vitro differentiation protocols for bone marrow stromal cells：disruption of actin cytoskeleton induces rapid morphological changes and mimics neuronal phenotype. J Neurosci Res.2004，77（2）：192～204.

4Gisetle Chamberlain， James Fox.Concise review： Mesenchymal stem cells：their phenotype， differentiation capacity， immunological features，and potential for homing.Stem Cells，2007，25（11）：2739～2749.

5Dominici M， Le Blanc K， Mueller I， et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy，2006，8：315～317.

6Atzori L， Poli QPerra A. Hepatic stellate cell： a star cell in the liver. Int J Biochem CellBiol，2009，41（8-9）：1639～1642.

7赵东长， 陈蕊， 余伟华， 等.骨髓间充质干细胞抑制肝星状细胞增殖与活化的体外研究.中国病理生理杂志.2005，21（6）：1139～1142.

8Su SB， Jiang HX， Wang DX， et al. Bone marrow mesenchymal stem cells modulate the expression of RhoA and P27 in hepatic stellate cells. Shijie Huaren Xiaohua Zazhi 2009， 17（32）： 3283～3291.

9Parekkadan B， van Poll D， Megeed Z， et al. Immunomodulation of activated hepatic stellate cells by mesenchymal stem cells. Biochem Biophys Res Commun，2007，363（2）：247～252.

10杨文，覃山羽，姜海行，等.应用SYBR荧光实时定量RT-PCR法检测BMSCs诱导大鼠肝星状细胞中DR5mRNA表达.蛇志，2012，24（1）：1～4.

11Lin N， Xie SJ， Pan WD， et al. Rat bone marrow mesenchymal stem cells induce hepatic stellate cells apoptosis in vivo.Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu yu Linchuang Kangfu，2010，14（10）： 1769～1774.

12Chen GZ， Jiang HX， Lu ZF， et al. Bone marrow mesenchymal stem cells modulate cell proliferation and apoptosis and RohA expression in rat hepatic stellate cells. Shijie Huaren Xiaohua Zazhi，2010，18（16）：1643～1649.

13史立军， 王菁华， 徐克达， 等. 骨髓基质干细胞对大鼠肝纤维化细胞凋亡的影响.中国生物制品学杂志，2008，21（11）：929～932.

14张君红，姜海行，孟云超，等.大鼠骨髓间充质干细胞旁分泌HGF上调肝星状细胞DR5及caspase-8的表达.基础医学与临床，2012，32（7）：804～808.

15Ong SY， Dai H， Leong KW. Inducing hepatic differentiation of human mesenchymal stern cells in pellet culture.Biomatefial，2006， 27（10）：4087～4097.

16Carvalho AB， Quintanilha LF， Dias JV， et al. Bone marrow multipotent mesenchymal stromal cells do not reduce fibrosis or improve function in a rat model of severe chronic liver injury. Stem Cells， 2008， 26（5）：1307～1314.

17Di Bonzo LV， Ferrero I， Cravan zola C， et al. Human mesenchymal stem cells as a two-edged sword in hepatic regenerative medicine：engraftment and hepatocyte differentiation versus profibrogenic potential. Gut， 2008， 57（2）：223～231.

浙江省年度重大科技专项计划项目（2011C130291-12011）

310053 浙江中医药大学（陈玲肖）310013 杭州中国人民解放军第117医院消化内科（宋水川 马炬明）