microRNAs调控动物骨骼肌细胞发育的研究进展

岳炳霖，陈　宏

(江苏师范大学细胞与分子生物学研究所，江苏师范大学生命科学学院，江苏 徐州 221116)

microRNAs调控动物骨骼肌细胞发育的研究进展

岳炳霖，陈宏*

(江苏师范大学细胞与分子生物学研究所，江苏师范大学生命科学学院，江苏 徐州 221116)

microRNAs( miRNAs) 是一类长度约为22个寡核苷酸左右的内源性单链非编码RNA，在动植物进化过程中十分保守。近年来研究表明，miRNAs参与细胞分化、增殖、凋亡等生理过程并发挥着重要的调节作用．本文综述了miRNAs的来源和作用机制，miRNAs对动物骨骼肌细胞增殖分化，再生以及肌纤维类型调节的最新研究进展。

microRNA；骨骼肌：肌肉发育

引言：

microRNA(miRNA)最早由Lee 等[1]在研究线虫发育的过程中被发现，是一类调节基因转录后表达的rna，广泛存在于动植物、病毒、及单细胞有机体中，具有高度的进化保守性，并且在表达上有显著的时空特异性[2]。miRNA主要与靶mRNA 的3' 端非翻译区(3'UTR)互补，引起靶基因mRNA降解或由于不完全配对造成的翻译抑制[3]，从而实现相应的生物学作用。近年来，大量参与基因转录后调控的miRNA被分析鉴定，它们广泛参与生物体的增殖、分化、信号转导、疾病产生与恢复等各个方面的调控。其中，miRNA作为转录后调控因子在骨骼肌发育中的作用及其相关调控网络逐渐明晰。

骨骼肌是脊椎动物身体中最丰富的组织，约占动物体总体重的40%[4]，主要由肌纤维，少量脂肪组织及结缔组织组成。骨骼肌发育是一个受多因素调节的复杂生物学过程，主要包括：成肌细胞的生成，成肌细胞增殖，分化，融合成肌管，肌管最终分化为肌纤维。在骨骼肌的发育过程中，不同发育阶段会形成不同类型的成肌细胞(胚胎成肌细胞、胎儿成肌细胞和卫星细胞)[5]。这些成肌细胞经过一系列的增殖、迁移、分化，最终形成多种类型的快、慢肌纤维[6]。动物骨骼肌的生长主要依赖肌纤维数目的增加和肌纤维横截面积的变大。其中，胎儿期主要发生纤维数目的增加，出生后则主要依靠原有肌纤维横截面积的变大增加肌肉含量[7]。

miRNAs对动物骨骼肌细胞发育的影响最早在敲除dicer基因的小鼠上得到证实，dicer基因编码的dicer酶将前体microRNA加工成成熟microRNA，它的敲除使得小鼠骨骼肌细胞发育不全，肌纤维形态缺陷，加速了骨骼肌细胞的凋亡[8]。此外miRNAs能够通过控制成肌细胞的增殖与分化过程调节肌肉生成。如miR-206 和miR-486能通过直接抑制Pax7的表达使成肌细胞退出增殖及细胞周期，进入分化阶段[9]。

许多miRNA具有组织表达特异性，据此miRNA可分为肌肉特异性的miRNA和非肌肉特异性的miRNA，两种类型的miRNA在肌肉的增殖及分化方面都扮演着重要角色。肌肉特异的miR-1[10]、miR-133[11]、和miR-206[12]参与骨骼肌细胞的增殖分化，其中miR-1，miR-133在骨骼肌及心肌中表达，miR-206被发现仅在骨骼肌中表达[13]。非特异性表达的miR-181[14]、miR-241[15]、miR-26a[16]、miR-27[17-18]、miR-29[19]、miR-125b[20]以及广泛表达的miR-155[21]、和miR-214[22-23]也参与成肌过程。骨骼肌细胞的增殖与分化是骨骼肌发育的核心问题，骨骼肌的再生与人肌肉相关疾病的治疗密切相关，肌纤维类型与肉品质密切相关[24-25]。由于有关肌肉发育的分子机制尚未彻底阐明，因此，通过深入研究miRNAs调控骨骼肌细胞发育的分子机制，有利于加深人们对动物骨骼肌增殖分化机制的理解，并为其在人骨骼肌相关疾病治疗，畜禽肉品质改善的应用方面提供理论依据。

1　microRNA的来源与作用机制

1.1microRNA的来源

microRNA在生物体内的生成经过细胞核内基因组DNA转录、加工、转移到细胞质、胞浆继续加工和装配等过程，涉及3个关键酶：RNA聚合酶Ⅱ、RNaseⅢ-Drosha、RNaseⅢ-Dicer。首先，在细胞核中DNA 聚合酶Ⅱ将基因组DNA转录为初级miRNA(pri-miRNA)[26-27]，之后RNaseⅢ-Drosha和双链RNA结合蛋白DGCR8将其剪切成含有70到120个核苷酸左右具有茎环结构的前体miRNA(pre-miRNA)[28]。随后pre-miRNA经转运蛋白-5(exportin-5) 转运进入细胞质[29]。在胞浆内内源性的RNaseⅢ-Dicer将pre-miRNA加工成成熟双链miRNA[30]，同时与TAR结合蛋白(TAR-binding protein，TRBP)结合形成RNA 诱导的沉默复合体装载复合物(RLC)[31]。之后RNA解旋酶解开RLC中成熟双链miRNA并在一种AGO蛋白的参与下形成RNA 诱导的沉默复合体(RISC)，RISC中成熟单链miRNA通过识别靶基因的3'UTR降解mRNA或抑制翻译[32]或通过快速脱腺苷酸化使mRNA降解[33]。Pre-miRNA除了来源于基因组DNA的转录外，最近Yang等研究表明一些Pre-miRNA由RNA剪切而来。microRNA还可以由诸如核仁小分子RNA(snoRNA)，转运RNA(tRNA)和内含子非编码RNA等内源性RNA产生[34]。

1.2microRNA的作用机制

miRNA 5'端2 -7个核苷酸被称为种子序列，它与靶mRNA 的3' 端非翻译区(3' UTR)完全互补，引起靶基因mRNA降解，而它们之间的不完全配对则造成翻译抑制，影响蛋白的表达水平。2006 年，Wu等研究表明，在哺乳动物细胞中，miR-125b 和let-7 能够快速脱腺苷酸化靶mRNA，去除mRNA 聚腺苷酸尾，从而抑制基因表达．这又提供了一个microRNA的作用机制。相关研究表明miRNA还可以在转录水平上通过对特异基因甲基化作用等方式沉默特定基因[35]。miRNA除了抑制靶基因表达，在特殊情况下也可以促进靶基因翻译。如miR-16能够靶向MYT激酶的mRNA，激活其在爪蟾卵母细胞中的表达[36]。microRNA对靶基因的调节是一个复杂并且需要高度协调的过程。大多数microRNA是通过对靶基因的微调来达到它们的抑制作用[37]。在同一种生物学过程中一个microRNA可以抑制多个mRNA，也可以是多个microRNA各自靶向相关位点或共同靶向同一位点，相互协调完成生物学过程。除此之外，microRNA可以在不同条件下抑制或者激活相关靶位点从而使得机体适应环境变化[38]。生物体的发育过程中几乎没有单一的microRNA发挥作用，越来越多的研究表明了microRNA调控的复杂性，不相关的microRNA，microRNA与转录因子相互作用共同参与同一生物学过程[39-42]。转录因子除了与microRNA启动子结合外，一些转录因子还能与pri-miRNA结合影响microRNA的生成[43]。竞争性内源RNA(ceRNA)通过与相关靶基因竞争性地结合microRNA，使microRNA与靶基因脱离。例如，具有肌肉特异性的长链非编码ceRNAlinc-MD1通过结合miR-135激活肌肉特异性基因表达的转录因子肌细胞增强因子(MEF2C)[44]，从而调节小鼠和人成肌细胞的分化。这为microRNA的转录后调控提供了新的机制。

2　microRNA对动物骨骼肌细胞增殖分化调控的研究现状

成肌细胞是动物生肌前体细胞。在脊椎动物胚胎中，成肌细胞来源于由体节分化而来的生皮肌节[45]，生皮肌节富含生肌祖细胞，它是由一类表达Pax3 和Pax7转录因子的增殖及未分化细胞[46]，生肌祖细胞增殖分化成成肌细胞。生皮肌节背侧及腹侧的生肌祖细胞分别构建了脊柱轴上方及下方的肌节，脊柱轴上方肌节经分化，延伸，融合形成深背部肌肉组织，脊柱轴下方肌节前体的一部分亚群分化为躯干肌，其余的继续保持增殖，分层，迁移形成隔膜、四肢和舌头肌肉组织[47-48]。

肌纤维的形成需要成肌细胞退出细胞周期，融合，伸长并保持末端分化[49]。成肌细胞在迁移的过程中，生肌调节因子myogenin和肌细胞增强因子MRF4开始表达，并且促使成肌细胞分化为肌管[50]。生肌调节因子包括：myogenin、Myod、Myf5、MRF4，是一类具有螺旋-环-螺旋结构的转录因子，与E蛋白二聚化并结合E boxes，是肌肉特异性基因的增强剂。其中Myod作为肌肉特异性基因转录的重要调节因子能促进成肌细胞分化，Myogenin与成肌细胞末端分化有关[51]。在末端分化前成肌细胞经历了一段增殖以及细胞静息周期[52]。当成肌细胞退出细胞周期，myogenin等生肌调节因子继续表达，成肌细胞分化融合成多核肌管，多核肌管含有由肌动蛋白和肌球蛋白组成的肌原纤维。随着肌原纤维的增多，细胞核逐渐靠向细胞膜，肌管最终转变成肌纤维[49]。肌节形成后，胚胎成肌细胞引起胚胎初级肌纤维的形成，之后胎儿成肌细胞引起次级肌纤维的形成，并起初包围在初级肌纤维周围。卫星细胞出现在刚形成的基膜下，处于肌纤维周围，用于产后肌纤维的生长及再生。

在骨骼肌中特异表达的microRNA被称为MyomiRs，控制着成肌细胞的增殖分化及肌肉组织的代谢平衡，如miR-1、miR-133a、miR-133b、miR-206、miR-208b[53-54]。miR-1/206家族包含miR-1-1、miR-1-2、miR-206，miR-133家族由miR-133a-1、miR-133a-2、miR-133b组成[42]。miR-1-1/miR-133a-2，miR-1-2/miR-133a-1以及miR-206 / miR-133b这三组肌肉特异性mirna在骨骼肌上的表达受包括血清应答因子(SRF)、生肌调节因子(Myod，myogenin)、肌细胞增强因子(MEF2)在内的一系列转录因子的调控[55-56]。miR-1、miR-133、miR-206 的启动子区含有Myod和Myogenin的结合位点，此外，miR-1的启动子区含有MEF-2 和血清应答因子(SRF)的结合位点，同时受MEF-2和SRF 的调控，生肌调节因子(Myod)可以通过结合E boxes激活miR-206/133b的转录[57]。

除了前面提到的MyomiRs，各种组织广泛表达的miRNAs也参与骨骼肌的发育和功能调控：miR-27靶向抑制Pax-3，促进骨骼肌早期分化[17]。miR-181可靶向同源异型框蛋白(Hox-A11)从而促进成肌细胞终末分化[14]。在骨骼肌细胞分化过程中表观抑制因子YY1 表达下调，miR-29t通过靶向YY1促进骨骼肌细胞的分化[19]。miR-214通过Hedgehog 信号转导通路影响慢肌纤维的产生[22]等。

2.1microRNA对动物骨骼肌细胞增殖的调控

在骨骼肌发育过程中，miR-1和miR-133作用相反，miR-1促进肌肉分化，而miR-133抑制肌肉分化、促进成肌细胞增殖。miR-133通过靶向抑制血清应答因子(SRF)，促进成肌细胞增殖。实验表明在爪蟾胚胎中过表达miR-133，虽然可以形成心肌组织，但不能形成心腔且不能环化。miR-1与miR-206共同下调PAX3的表达从而抑制横纹肌肉瘤细胞的增殖[58]，miR-206通过靶向高迁移率族蛋白基因Hmgb3[59]以及调控DNA聚合酶的合成，对骨骼肌细胞增殖分别起着促进、抑制作用，这表明miR-206 对骨骼肌细胞增殖的促进和抑制随着通路改变将发生变化。

在小鼠成肌细胞中，miR-214既可以促进成肌细胞的增殖，又可以促进其分化[23]；miR-27a通过靶向肌肉生长抑制因子(Myostatin)，促进成肌细胞的增殖[17]；miR-23a 通过调控泛素蛋白连接酶促进肌细胞增殖[60]。同时，成肌细胞的增殖过程也受到一些miRNAs的抑制。例如，MiR-29通过下调Akt3基因的表达抑制小鼠成肌细胞的增殖并促进肌管形成[19]，miR-682在成肌细胞增殖过程中表达上调，抑制miR-682可使细胞增殖受阻[61]。miR-128a通过靶向抑制胰岛素受体底物-1(Irs-1)下调肌细胞的增殖，同时mir-128a又受肿瘤坏死因子(TNF)的调节促进肌细胞的增殖，它们之间形成一个反馈环，调节着肌细胞增殖平衡[62]。

2.2microRNA对动物骨骼肌细胞分化的调控

通过microrna调控基因表达是动物骨骼肌细胞分化所必需的，肌肉分化相关基因MHC Myod、MEF2、Pax3、YY1等受一系列肌肉特异性以及非特异性microrna的调控。例如miR-1/206家族的miRNAs在成肌细胞分化过程中就扮演着重要角色。当成肌细胞分化为肌管的过程中，miR-1和miR-133的表达上调。组蛋白去乙酰化酶(HDAC4)是miR-1的靶位点，又是转录因子肌细胞增强因子(MEF2)的抑制剂。肌细胞增强因子(MEF2)上调miR-1的表达，而miR-1靶向抑制组蛋白去乙酰化酶(HDAC4)激活了肌细胞增强因子(MEF2)，从而进一步促进成肌细胞分化。实验证明在果蝇幼虫肌肉有丝分裂后生长过程中miR-1的丢失导致果蝇肌肉严重变形[63-64]。此外，表观抑制因子通过调节miR-1的表达影响骨骼肌分化[65]。miR-206在成肌细胞分化中上调，并通过抑制DNA聚合酶a亚基(pola1)，连接蛋白43(connexin 43)、卵泡抑制素1(FSTL1)以及和肌营养相关蛋白使细胞退出细胞周期进入终末分化[66～69]。然而miR-206在活体肌肉分化上的调节仍然不清楚，因为有证据表明缺乏miR-206的小鼠肌肉显示正常发育[70]。

除此之外miR-27a通过减少肌生成抑制蛋白的表达量，促进肌细胞分化；miR-26通过靶向抑制转录因子Smad1和Smad4 促进肌细胞分化；miR-378 和miR-181能够间接促进Myod的表达促进肌细胞分化，而miR-699a/699q直接靶向抑制Myod的表达从而抑制肌细胞分化。miR-155和miR-135通过抑制肌细胞增强因子2a(Mef2a)的表达抑制肌细胞的分化。miR-24的抑制可显著减少MEF2D、Myf5、Myod、Myogeniny以及 MHC的表达，从而严重影响着成肌分化[71]。以上表明microrna可以通过直接或间接的方式调控肌肉发育相关基因，并受肌肉发育相关基因的反馈，microrna与肌肉发育相关基因间的相互作用加深了对microrna在动物骨骼肌细胞增殖分化调控中的理解。

3　microRNA对动物肌细胞修复的研究现状

骨骼肌在经过损伤，运动，疾病等肌肉营养不良过程后具有显著地再生修复能力。这种再生能力依赖于卫星细胞，它是一类用于产后肌纤维的生长及再生的异源性干细胞。卫星细胞位于基膜下，被肌纤维围绕，一般情况下维持在有丝分裂的静止状态，保持有限的基因表达及蛋白合成[72-73]。一旦受到损伤或疾病等内在或外在的信号的激活，卫星细胞将离开原来的位置重新进入细胞周期。激活的卫星细胞将进入肌肉生成途径，表达生肌调节因子(MRFs)Myod和Myf5[74-76]。多轮增殖后，成肌细胞开始分化形成多核肌纤维，并相互融合与现有的肌纤维重建肌肉组织。未激活的卫星细胞则通过不对称细胞分裂来补充静息干细胞[77]。

microRNA在维持卫星细胞静息以及增殖分化方面具有重要作用。miR-489在静息的卫星细胞中高表达，而在卫星细胞激活的时候急剧下调，miR-489通过抑制能够促进生肌祖细胞增殖扩张的癌基因DEK维持卫星细胞的静息状态， 其中DEK能够促进生肌祖细胞增殖。实验显示卫星细胞dicer酶的特异性缺失导致其静息状态的自发终止，卫星细胞进入细胞周期并开始增殖，同时卫星细胞的子代也出现大量凋亡[78]。在静息态的卫星细胞中，Myf5位于MRNP颗粒中，受到miR-31抑制。一旦卫星细胞受到激活，MRNP颗粒分离，Myf5解除抑制，Myf5蛋白得到快速翻译和积累，从而标记激活的成肌细胞，促进肌肉生成[79]。Myod能够上调相关microRNA的表达，激活的卫星细胞促进了Myod的表达，还激活了骨骼肌生肌通路，例如miR-206在激活的卫星细胞中显著上调，miR-206通过靶向转录因子配对盒7(Pax7)的3'UTR直接抑制Pax7表达从而限制卫星细胞的增殖并利于其分化。Pax7在静息和激活卫星细胞中都能表达，并且在静息卫星细胞维持和自我更新中是必需的[80]。在受到膜毒素侵扰后，miR-351表达量急剧上升，通过靶向可抑制细胞增殖的E2f3促进卫星细胞增殖[81]，而在同样受膜毒素侵扰的情况下，miR-125b表达量却显示下调，它的靶基因类胰岛素生长因子2(IGF-2)调节肌肉生成[82]。以上研究结果说明，miRNA在骨骼肌细胞修复中具有重要的作用，挖掘和深入研究新miRNA在骨骼肌再生中的作用机制意义重大。

4　microRNA对动物骨骼肌纤维类型调控的研究现状

骨骼肌是由一系列不同生理及代谢参数的异质肌纤维组成，具有多种功能性质的肌肉群。根据骨骼肌肌球蛋白重链亚型差异将肌纤维分为I 型、IIa型、IIb型与IIx型4 种类型(I 型俗称“慢肌”，II型俗称“快肌”)。所分出的4 种肌纤维表现出不同的生理与代谢特征，其中I 型和IIa型肌纤维表现出氧化代谢特性，而IIb型和IIx型肌纤维表现出主要的糖酵解特性，肌纤维类型与肉品质密切相关，慢速氧化型肌纤维直径小，脂质和肌红蛋白含量高，有助于增加肌肉的嫩度、多汁性和风味[24]。肌纤维的总数在胎儿出生前已经固定，但肌纤维类型的变化却贯穿整个生长发育过程。在骨骼肌的生长发育过程中，骨骼肌肌纤维类型的相互转变遵循I 型?IIa型?IIx型?IIb型的变化规律[83]。肌纤维类型形成的分子调控机制非常复杂，涉及到许多的信号通路、基因与转录因子[84]。肌肉特异性microRNA(miR-208、miR-208b、miR-499)分别由三个肌肉特异性肌球蛋白重链基因(Myh6、Myh7、Myh7b)的内含子编码而来[56]。这三个microRNA在种子序列上具有显著的同源性，这表明它们在调节同一靶点的过程中具有相同的功能。I 型肌纤维的肌球蛋白由Myh7，Myh7b编码，miR-499通过直接靶向3个Myh7基因抑制剂：Sox6、Pur?、Thrap1增加I 型肌纤维的数量[85]。miR-208b能够增强Myh7b 及miR-499的表达并且激活I 型肌纤维的形成，但相关机制尚不清楚。miR-208及它的编码基因Myh6只在心肌中表达，与miR-499类似，miR-208也通过靶向Sox6、Pur?、Thrap1促进I 型肌纤维的形成。相反，由于miR-208b，miR-499的显著下调，I 型肌纤维生成受到抑制，II型肌纤维得到激活[86]。在骨骼肌中，miR-208b和miR-499通过激活I 型肌纤维基因抑制II型肌纤维基因共同控制肌纤维的形成。实验显示miR-499在骨骼肌中过表达引发了比小鼠目鱼肌II 型肌纤维向I 型肌纤维的转化，缺乏miR-208b 和miR-499的比目鱼肌显示大量I型肌纤维的丢失。在小鼠新生儿骨骼肌细胞中有条件敲除Sox6导致II 型肌纤维向I 型肌纤维的转化，同时伴随骨骼肌性质与功能的改变[87]。

除此之外miR-1、miR-23a也可调节骨骼肌纤维类型分化，miR-208b 和miR-499 主要起着延缓肌纤维转型的作用，而miR-23a 和miR-1 决定肌纤维的分化类型[88]。2009 年，van等[54]证实，肌球蛋白编码的miRNA通过与不同肌球蛋白重链亚型形成相互作用网络，影响肌球蛋白的表达和肌纤维类型。这些研究揭示了miRNA在调控骨骼肌类型中的重要作用。

5　展望

miRNA是多种生物学通路的关键调节因子，在骨骼肌细胞增殖分化、再生以及肌纤维类型调节等方面发挥作用。目前miRNA在肉牛上的研究集中于肌肉生长发育、繁殖、育种和胚胎存活等方面，主要依托相关miRNA的深度挖掘及其功能鉴定。尽管大量的miRNA及其在肉牛骨骼肌中的作用靶点得到鉴定，但是其具体的调控机制仍需进一步研究，例如miRNA介导的肌肉发育调控网络，miRNA与肌细胞增殖分化重要信号通路的相互作用等。探究并阐明miRNA在肉牛肌肉发育过程中的调控机理将为改良肉牛肉品产量、质量提供理论依据，为产肉性状的分子改良提供新的思路。

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Research Progress on MicroRNAs Regulating Animal Skeletal Muscle Cell Development

YUE Bing-lin,CHEN Hong*

(InstituteofCellularandMolecularBiology,CollegeofLifeSciences,JiangsuNormalUniversity,Xuzhou,Jiangsu, 221116,China)

microRNAs(miRNAs)are a class of small(About 22 nucleotides)endogenous noncoding single-stranded RNAs which are very conservative in the evolution of plants and animals. Recent studies shown that miRNAs play an important role in cell differentiation，proliferation，apoptosis and other physiological processes. This paper summarized the origin and mechanism of miRNAs, and the latest research progress of miRNAs on the proliferation, differentiation, regeneration and regulation of muscle fiber type of skeletal muscle cells.

microRNA；skeletal muscle; muscle development

2015-03-19修改日期:2015-03-25

国家自然科学基金项目(31272408)；国家肉牛牦牛产业技术体系专项(CARS-38)；陕西省科技统筹创新工程计划项目：(2014KTZB02-02-02-02，2015KTCL02-08)；国家发改委生物育种能力建设与产业化专项(2014-2573)。

岳炳霖(1992-)，男，在读硕士生，研究方向：动物遗传资源与利用。E-meil：yuebinglin123@163.com。

陈宏(1955-)，男，陕西西安人，教授，博士生导师，主要从事分子遗传学与家畜育种。

S823.2

A

1001-9111(2015)05-0070-07