生物样本库冷冻样本的质量控制新进展

嵇承栋， 章佳英 综述， 于德华 审校

(同济大学附属杨浦医院科研管理科，上海 200090)



·综 述·

生物样本库冷冻样本的质量控制新进展

嵇承栋， 章佳英 综述， 于德华 审校

(同济大学附属杨浦医院科研管理科，上海 200090)

生物样本库作为基础研究成果向临床应用转化的平台,在疾病诊断、新药研发、疾病相关基因检测及流行病学研究中均有重要作用。对生物样本库全程进行质量管理和控制，制定标准化操作流程，收取临床资料及随访资料完整的患者血清、血浆、血细胞、组织等样本，并按照各自的标准化操作流程进行处理、分装、储存和使用。质量管理既是样本库建设的关键，也是样本库运转的中心环节，还是高质量规范化医学研究的基础保障。本文旨在探讨生物样本库冷冻样本质量管理体系的构建。

生物样本库； 质量控制； 冷冻样本； 综述

标准化、高质量的生物样本库是重大疾病或罕见疾病基础与临床研究、先进临床诊疗技术及药物靶点研发、健康预防研究，即实现转化医学的重要源头与关键环节之一，毫无疑问也是当今生命科学原创性研究、生物医药产业自主创新体系中至关重要的环节与保证。因此，生物样本库被认为是连接基础研究与临床应用的桥梁。

1 生物样本库冷冻样本的质量控制

1.1 生物样本库的定义

广义的生物样本库按照经济合作与发展组织2001年的定义可称为生物资源中心。具体定义为： 生物资源中心是支撑生命科学和生物科技的基础设施，包括众多储存和供应机构，提供活细胞、有机体基因组以及与生物系统的遗传和功能相关的信息。生物资源中心收集可培养的生物体(如微生物、植物、动物以及人类细胞)及其中可复制的成分(如基因组、质粒、病毒、cDNA)、有活性但是不能培养的有机体、细胞和组织与含有这些收集物的分子、生理、结构信息以及相关生物信息学的数据库。

1.2 生物样本库冷冻样本的种类

生物样本库收集的生物样本包括体液样本和组织样本。体液样本又分为唾液、血液、尿液、精液、乳汁、粪便等；组织样本分为组织、毛发、指甲等；而从血液样本中又可分离出血浆、血清、红细胞、PBMCs(外周血单个核细胞)、DNA和RNA等；以及与这些生物样本相关的知情同意、病理、临床、治疗和随访等资料及其质量控制与信息管理系统。

1.3 生物样本库质量控制的定义

生物样本库质量控制是在质量方面指挥和控制生物样本库的过程，也是在质量方面指挥和控制生物样本库建立方针和目标并为实现这些目标而相互关联或相互作用的一组要素。这里的要素包括： 组织结构、程序、过程和资源，涉及生物样本库在收集样本过程中的标准化操作规程和相应的保存条件和在诊断分析过程中的可行性和准确性的质量控制。

1.4 生物样本库质量控制的标准

迄今为止，国际上尚无统一的生物样本库质量管理标准体系，用于不同下游实验的样本都有最适的收集方法，放置时间、固定方法及相应的储存条件和时间。相应的质量控制范围主要包括： 血清和血浆样本用于测定K+、白介素类、维生素E、金属蛋白酶类、肾上腺皮质激素等指标时对样本离心前后的放置时间，存储时间、存储温度、存储条件等都做了相应规定；尿液样本用于测定肿瘤坏死因子、肾上腺素、抗胰蛋白酶等指标时对离心前放置时间、储存条件、冻融方式等做了相应规定；脑脊液用于测定半胱氨酸蛋白酶抑制剂对样本的储存条件做了具体要求；固体组织样本用于测定次黄嘌呤磷酸核糖转移酶、血管紧张素转换酶抑制剂、肌动蛋白等指标时对组织的缺血时间做了具体要求。

2 生物样本库冷冻样本的质量控制情况分析

从Pubmed数据库用检索式(biobank*) AND quality control，收集文献共108篇，Biopreserv Biobank杂志收录最多，其次是Clin Biochem杂志。其中在2010—2014年，挑选了30篇关于生物样本库冷冻样本质量控制的文章，涉及蛋白质、DNA、RNA和组织样本等[1-4]。

2.1 生物样本库冷冻样本的质量控制研究工作的排名

关于全球的生物样本库冷冻样本的质量控制工作机构，西方国家在生物样本库质量控制方面的研究机构较多，排名前几位的主要集中在欧洲： 意大利(15.29%)、瑞典(15.14%)、挪威(14.08%)、英国(13.57%)，这可能与建设生物样本库起步早有关，此外法国所占比例为11.10%、加拿大为10.63%。近年来，亚洲的韩国(10.91%)和中国(9.28%)也开始重视这方面的研究，逐渐在生物样本库冷冻样本的研究机构中占有一席之地。

2.2 生物样本库冷冻样本的质量控制研究所关注的方向

生物样本库冷冻样本的质量控制工作，研究最多的是蛋白质(58.62%)、RNA(25.00%)，其次是维生素(4.74%)、肽(2.37%)、激素(2.59%)。

收集的样本类型主要集中在组织样本(25.65%)，其次为血浆样本(19.07%)(包括EDTA、柠檬酸钠、肝素抗凝的血样本)、PBMCs(18.97%)(包括柠檬酸钠、ACD、EDTA抗凝的血液样本)、血清(16.92%)、尿液(14.22%)，另外，也有收集脑脊液(5.17%)样本的样本库。

3 生物样本库冷冻样本的质量控制特点

3.1 DNA样本的质量控制

全血中提取的DNA，可以用于全基因测序、SNP基因实验和其他的DNA实验。DNA的质量涉及浓度、纯度和序列等方面内容[5]。一般情况下，光谱分析法通常用于核苷酸浓度及纯度的评估(包括DNA或RNA)。因为DNA和RNA在260nm附近有最大吸收峰，蛋白质的最强吸收峰在280nm附近。而一些杂质，如EDTA、碳水化合物、酚等物质在230nm处有吸收峰。因此，A260/A280和A260/A230的比值即可代表核苷酸的纯度。如DNA样品的A260/A280比值在1.8～2.0之间，A260/A230>2.0，说明纯度高。然而，DNA样品的A260/A230比值在1.7～2.0之间，也能用于分子生物学实验。DNA浓度(μg/ml)的计算公式： 50×OD260。荧光染料，如PicoGreen、Hoechest 33258和SYBR Green Ⅰ一直被用来评价DNA双链的数量。其中，PicoGreen(激发波长是480nm，发射波长是520nm)，测定DNA最敏感、最方便。DNA的完整性则采用两种方法分析，凝胶电泳和PCR。微量的DNA降解即可以从凝胶电泳中看出，同时还能估算DNA浓度。DNA的完整性采用凝胶电泳分析，DNA的纯度规定为A260/A230比值≥1.8，1.8≤A260/A280比值≤2.0。如果凝胶电泳发现DNA有降解，则进一步作PicoGreen分析。

Ruan L[5]等人选择了小牛胸腺作为DNA参考材料，DNA浓度测定采用光谱分析法(NanoDrop 2000 Spectrophotometer与Eppendorf BioSpectro-meter)，评价了两种仪器的精密度、准确性和线性，同时也作了批内和批间调查。期间，利用了West-gard’s规则来控制样本的DNA质量。结果，NanoDrop 2000 Spectrophotometer更能准确表达DNA的浓度。

3.2 RNA样本的质量控制

与DNA相比，RNA较难保存，因此有人使用特殊的采血管收集血液，提取RNA。Zhang[7]等比较了EDTA-K2和PAXgene Blood RNA Tubes两种血液采集管中mRNA的变化，以及各个时间点和不同的保存温度对mRNA的影响。实验筛选出40个基因，PAXgene Blood RNA Tubes采血管选出了16个最有质控意义的基因；而EDTA-K2采血管中，选出了24个最有意义的候选质控基因，其中8个显著低表达和16个显著高表达。这些生物标志物得到了SPIDIA-RNA的进一步验证，证明了这些生物标记物可以作为质量控制工具分析血液样本中mRNA的变化。

在Erasmus MC tissue bank中，每年随机抽取库存样本的2%，提取RNA测定其完整性(RIN)。评价了保存20年的癌组织样本，15年的肝脏样本(-80℃)，13年的病理活检组织(液氮保存)，认为不同的保存方法及温度和时间之间并无差别。一般来说，RIN低的组织样本，其脂肪、纤维和坏死组织含量往往较高，当样本的RIN≥6.5时，其受检样本肿瘤部分≥90%。而Le Page C等人[2]认为RIN数量≥7即是好的RNA。

冷冻干燥法能够保存组织形态、DNA、蛋白质，但RNA在1～2年后出现缓慢降解。最近，有研究人员尝试了生物样本的新保存技术[8-9]。

3.3 新鲜冷冻组织质量控制

福尔马林固定石蜡包埋组织有很大的实用价值，但是用途受到限制。保存良好的组织样本是基因组、转录组和蛋白质组研究的前提，为研究者提供高品质的生物样本及相关信息是生物样本库的使命。在NBK[10]中，随机抽检储存样本的3%，测定组织中提取的RNA，其质量评估包括两个方面，即浓度和纯度。RNA的浓度采用分光光度法测定，RNA的完整性采用凝胶电泳法鉴定。研究结果表明，组织形态学和蛋白质的稳定性得到了很好的保护。事实上，从真空冷藏系统保存组织中提取的RNA可以用于基因扩增，但是需要采用更高敏感性的检测方法，如RT-PCR。从上述研究结果可以得出，该真空冷藏系统适合于生物样本的短期保存[8-9]。

磷酸化蛋白是一种不稳定的蛋白质，生物样本处理过程将会影响其稳定性。Kofanova[11]等人研究了关于磷酸化蛋白的组织稳定性和蛋白质提取方法，比较了heat stabilization和snap-freezing两种方法，和两种蛋白质提取方法(两种不同的提取缓冲液： 一种是8M尿素；另一种是Bio-Rad缓冲液，不含尿素)。对于snap-freezing样本，两种缓冲液得到的蛋白质产量无差别。而对于heat stabilization样本，用尿素缓冲液提取的蛋白质总量明显低于不含尿素的缓冲液。然而，用heat stabilization样本的特异磷酸化蛋白浓度明显高于速冻样本。用BioPlex分析了磷酸化蛋白Akt、p-ERK 1/2、p-lkBa、p-JNK和p38 MAPK，得出用作磷酸化蛋白分析的组织样本，可以采用heat stabilization的方法，同时，BioPlex磷酸化蛋白分析可以作为评估组织样本完整性的质控方法。

如果尚未获得组织对缺血耐受程度的资料，权宜之计，可以采用在20min内速冻的方法。组织样本的反复冻融次数也因组织类型而异，组织样本保存在-80℃中时，DNA和蛋白质可以稳定数年，而RNA则只能保存5年。RNA可以借助RNAlater或其他RNA稳定液，放置-80℃能够适当延长保存期。-150℃的保存效果是否比-80℃好，尚未得到证实。

3.4 液氮罐微生物污染控制

微生物的污染情况与生物样本的来源有关，一定程度上取决于样本捐献者的健康状况。而微生物的污染情况可以用特殊引物(16S rRNA)结合PCR的方法证实。NBK等[10]研究了保存6～35年液氮罐中胚胎冻存管中的微生物污染情况，随机抽样发现了32种细菌和一种真菌。被检出的细菌有大肠埃希菌，即自然界中广泛存在的正常菌群；其中，最常见的是嗜麦芽寡养单胞菌，这种细菌在体外可以严重影响土壤肥沃程度及胚胎发育，进一步用脉冲场凝胶电泳分析发现这种细菌并非由于液氮与胚胎的交叉污染引起。

3.5 淋巴母细胞样细胞系(LCLs)的质量控制

淋巴母细胞样细胞系是一种细胞株，广泛应用于各种研究。在生物样本库建设中，主要作为大量DNA的来源，用于质量控制研究。一般来说，细胞的质量评估涉及细胞活力、细胞的鉴定和微生物污染情况等方面。细胞活力代表细胞的增殖能力；细胞的鉴定主要看是否有交叉污染，可以借助形态学工具检测、DNA染色或免疫表型分析[12]。

4 结语与展望

总之，在质量控制过程中，除了标准化操作规程与保存方法，还有人试图寻找监测生物样本稳定性的标记物。然而，目前只有少数标志物符合这些标准，如ProGRP可以用于血清/血浆样本的处理和储存的候选指标[1]；如CD40L用于评估血清在高温中暴露的时间；VEGF用来评价样本冻融的次数。不过，稳定标记物随着生物样本的使用目的而异[13]，不能一概而论，至今尚无统一的稳定标记物，质量评估方法也应该根据后续实验而调整，最理想的方法是那些有已知预分析标准和质控分析物的参考范围。因此，制定生物样本质量的全面评价标准和研制多项质量控制标记物已迫在眉睫。

[1] Brimo F, Aprikian A, Latour M, et al. Strategies for Biochemical and Pathologic Quality Assurance in a Large Multi-Institutional Biorepository; The Experience of the PROCURE Quebec Prostate Cancer Biobank[J]. Biopreservation and biobanking, 2013,11(5)： 285-290.

[2] Le Page C, Köbel M, De Ladurantaye M, et al. Specimen quality evaluation in Canadian biobanks participating in the COEUR repository[J]. Biopre-servation and biobanking, 2013,11(2)： 83-93.

[3] Shabihkhani M, Lucey G M, Wei B, et al. The procurement, storage, and quality assurance of frozen blood and tissue biospecimens in pathology, biorepository, and biobank settings[J]. Clinical biochemistry, 2014,47(4)： 258-266.

[4] Wei B-R, Simpson R M. Digital pathology and image analysis augment biospecimen annotation and biobank quality assurance harmonization[J]. Clinical bioc-hemistry, 2014,47(4)： 274-279.

[5] Ruan L, Song Y, Fan J, et al. The Shanghai Biobanking DNA Quality Control Program[J]. Biopreservation and biobanking, 2014,12(4)： 259- 264.

[6] Yin P, Peter A, Franken H, et al. Preanalytical aspects and sample quality assessment in metabolomics studies of human blood[J]. Clinical chemistry, 2013,59(5)： 833-845.

[7] Zhang H, KorenkovV, Sjöback R, et al. Biomarkers for Monitoring Pre-Analytical Quality Variation of mRNA in Blood Samples[J]. PloS one, 2014,9(11)： e111644.

[8] Lou J J, Mirsadraei L, Sanchez D E, et al. A review of room temperature storage of biospecimen tissue and nucleic acids for anatomic pathology laboratories and biorepositories[J]. Clinical biochemistry, 2014,47(4)： 267-273.

[9] Condelli V, Lettini G, Patitucci G, et al. Validation of Vacuum-Based Refrigerated System for Biobanking Tissue Preservation： Analysis of Cellular Morphology, Protein Stability, and RNA Quality[J]. Bioprese-rvation and biobanking, 2014,12(1)： 35- 45.

[10] Lee JE, Kim JH, Hong EJ, et al. National biobank of Korea： quality control programs of collected-human biospecimens[J]. Osong Public Health and Research Perspectives, 2012,3(3)： 185-189.

[11] Kofanova OA, Fack F, Niclou S P, et al. Combined effect of tissue stabilization and protein extraction methods on phosphoprotein analysis[J]. Biopr-eservation and biobanking, 2013,11(3)： 161-165.

[12] 桂馨,钱洁,许洁,等.细胞培养过程中支原体污染的检测及预防[J].同济大学学报： 医学版,2013,34(3)： 24-27.

[13] Teunissen CE, Tumani H, Engelborghs S, et al. Biobanking of CSF： International standardization to optimize biomarker development[J]. Clinical bioc-hemistry, 2014,47(4)： 288-292.

Recent progress in quality management system of biobank frozen samples

JICheng-dong，ZHANGJia-ying，YUDe-hua

(Yangpu Hospital， Tongji University School of medicine， Shanghai 200090， China)

Biobank is the fundamental platform for translational research, it also plays a crucial role in disease diagnosis, new drug development, disease-related gene detection and epidemiological studies. Biobank quality management system is the entire process of quality management and control, including standard operation procedure for processing, packaging, storage and use of serum, plasma, blood cells and tissue samples from patients with complete clinical and follow-up data. Quality management is essential for biobank operation and the guarantee for high quality and standardization of medical research. This article reviews the recent progress in establishment of quality management system for biobank frozen samples.

biobank; quality management; frozen samples; summarize

10.16118/j.1008-0392.2015.06.028

2015-02-03

上海市科学技术委员会科研项目(12692108700)；上海市卫生局面上科研项目(090092)

嵇承栋(1976—)，男，硕士.E-mail：15800397667@163.com

于德华.E-mail： ydh1404@sina.com

R 446

A

1008-0392(2015)06-0133-04