温肾活血化湿方对肾间质纤维化大鼠肾组织TGF-β1、sm ad7蛋白表达的影响*

李建省，王宝蕊

甘肃省中医院，甘肃 兰州730050

肾间质纤维化（RIF）是几乎所有慢性肾脏疾病发展至终末期肾脏病的最后共同通路。RIF主要病理改变为大量成纤维细胞及肌成纤维细胞增生，细胞外基质产生和堆积导致肾小管间质纤维化、肾小球硬化，最终导致肾功能衰竭。目前，针对肾间质纤维主要采取抑制或清除促纤维化因子方法，转化生长因子β（TGF-β）是肾间质纤维化发生、发展的关键因子。目前所知smads蛋白是TGF-β受体唯一的胞内信号传导，TGF-β/smad信号传导通路是RIF主要的最终共同通路。因此，阻断肾间质纤维化某些关节环节，可能阻止肾纤维化的发生、发展从而达到治疗慢性肾脏病治疗目的。在前期的临床研究中我们发现温肾活血化湿方具有改善肾功能，降低尿蛋白，延缓慢性肾功能衰竭的功效。本研究利用UUO法复制肾间质纤维化大鼠模型，观察温肾活血化湿方对其肾组织结构及 TGF-β1，smad7蛋白表达的影响，初步探讨其对该模型大鼠肾组织TGF-β/smad信号传导通路的影响及其防治肾间质纤维化的作用机制。

1 材料与方法

1.1 药物及试剂 氯沙坦（杭州默沙东公司生产，国药准字：J20B0148）。TGF-β1，smad7(兔抗大鼠多克隆抗体)、免疫组化二抗及DAB试剂盒（武汉博士德）。温肾活血化湿方（药物组成：黄芪30 g，川芎10 g，续断10g，牛膝10g，菟丝子30g，桂枝30g，白豆蔻10 g）。

1.2 动物分组及给药 清洁级3～4周龄雄性SD大鼠120只，体质量180～210 g，兰州大学医学院动物中心提供，医学动物合格证号 SCXK（甘）2009-0004，参照文献[1]方法采用单侧输尿管结扎手术(UUO法)建立肾间质纤维化大鼠模型，随机分为假手术组、UUO组、温肾活血化湿方组、氯沙坦组，每组20只。以5%水合氯醛腹腔注射麻醉，从右侧旁正中切口剪开腹壁，暴露右侧输尿管，结扎右侧输尿管，关闭腹腔。假手术组只分离但不结扎输尿管。术后第2天给药，假手术组、UUO组给予相应生理盐水，氯沙坦组灌胃给予氯沙坦（10mg·kg-1·d-1）混悬液，温肾活血化湿方组给予温肾活血化湿方（我院制剂室经水煮提取，含生药2 g/mL，按换算系数换算成大鼠灌胃给药）水煎液(9.8 g·kg-1·d-1)。术后第 7、14、21天每组处死10只大鼠，切除右肾，肾组织部分行甲醛固定、脱水后包埋备用，其余液氮中保存备用。

1.3 观察指标

1.3.1 考马斯亮蓝法测定尿蛋白定量 第7、14、21天分别用代谢笼收集大鼠24小时尿液，用考马斯亮蓝法测定24小时尿总蛋白定量。

1.3.2 肾组织病理检测 取右侧肾组织切片，进行苏木素-伊红（HE）、Masson染色，在光镜下观察肾脏组织形态结构变化情况

1.3.3 肾组织TGF-β1、smad7蛋白表达 按照两步法免疫组化检测试剂盒(HRP-多聚体抗兔)操作步骤进行，PBS代替一抗作为阴性对照，DAB显色，苏木素轻度复染，光镜下观察肾组织TGF-β1、smad7蛋白的表达。光镜下细胞核、细胞浆出现棕黄色颗粒为阳性信号。采用Image-Pro Plus 6.0图像分析软件半定量分析免疫组化图片。根据累计吸光度（A）与面积之比值，选取10个不重叠视野，计算单位面积阳性染色区域的平均A进行统计学分析。

1.4 统计学方法 采用SPSS 13.0软件进行统计分析，计量资料用(χ±s)表示，采用t检验，P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 24小时尿总蛋白定量 与模型组相比较，造模后第14天温肾活血化湿方尿蛋白定量明显降低（P＜0.05）,第21天温肾活血化湿方与模型组比较差异有统计学意义（P＜0.05）。见表 1。

表1 各组大鼠24小时尿总蛋白定量(χ±s)mg/24h

2.2 大鼠肾组织TGF-β1蛋白表达 与模型组比较，假手术组大鼠在第7、14、21天肾小管上皮细胞胞浆中TGF-β1蛋白表达增多（P＜0.05），温肾活血化湿方组、缬沙坦组与模型组相比较TGF-β1蛋白表达明显降低（P＜0.05）。见表2。

2.3 大鼠肾组织smad7蛋白表达 与模型组比较，假手术组大鼠在第7、14、21天肾组织smad7蛋白表达升高（P＜0.05），温肾活血化湿方组、氯沙坦组与模型组相比较smad7蛋白表达明显增加（P＜0.05）。见表3。

表2 各组大鼠肾组织TGF-β1蛋白表达的比较(χ±s)

表3 各组大鼠肾组织smad7蛋白表达的比较(χ±s)

3 讨论

肾间质纤维化是慢性肾脏病最终的共同通路。TGF-β1诱导肌成纤维细胞激活并导致细胞外基质生成，进而导致肾纤维化和肾小管萎缩[2]。因此，抑制TGF-β1诱导的肌成纤维细胞活化是抑制肾间质纤维化的治疗策略。目前，肾间质纤维化动物模型有UUO、5/6肾切除(subtotal nephrectomy，STNx)、环孢素A肾病等多种模型。UUO模型是研究肾小管间质纤维化公认的模型。输尿管结扎导致肾间质纤维化，引起肾脏弥漫性损害[3-4]。

肾间质纤维化属于中医学“关格”“溺毒”“水肿”“虚损”等范畴。刘玉宁认为“虚、痰（浊）、瘀、毒”是导致肾间质纤维化发生、发展之关键。樊均明以“肾痿”立论。王献耀教授提出“肾络微型癥瘕”是肾纤维化的中医病机[5]。益气活血化浊、补肾活血、温阳法为其治疗大法[6]。我们认为虚、瘀、痰湿是导致慢性肾脏病肾间质纤维化发生、发展之关键。肾虚为本，痰（浊）、瘀为标，毒是加重肾间质纤维化不可忽视的方面。在慢性肾脏病4～5期，以脾肾阳虚为主，我们认为肾阳虚肾络瘀阻为肾间质纤维化主要病机，因此我们用温肾活血化湿法治疗慢性肾脏病临床效果满意。温肾活血化湿方由黄芪、川芎、红花、续断、牛膝、菟丝子、淫羊藿、桂枝、干姜、白豆蔻、白芷组成，具有温肾活血，健脾化湿之功效，为治疗慢性肾脏病有效方剂。已有研究证实，黄芪、川芎能调节细胞免疫及体液免疫，降低尿蛋白，保护肾功能。通过下调TGF-β表达，抑制肾小管转分化、下调ECM的主要成分、下调CTGF表达等多途径多靶点抑制肾小管上皮细胞增殖，抑制肾小管上皮细胞转分化，改善肾间质纤维化[7]。补肾益气法能抑制成纤维细胞过度活化，促进其凋亡[8]。补肾活血中药可以加速细胞外基质降解，减少细胞外基质积聚，从而防治肾小球硬化[9]。益气活血方通过下调TGF-β、上调smad7的表达来遏制肾纤维化的进展[10]。

本研究结果表明，温肾活血化湿方具有降低模型大鼠尿蛋白作用，通过减少TGF-β1表达，上调smad7蛋白表达，减轻肾间质纤维化，为进一步研究该治法及其方药提供实验依据。

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