中药对肺癌细胞凋亡诱导基因表达的影响*

丁明明，吴勉华△

1南京中医药大学，江苏 南京 210029；

2江苏省中医药防治肿瘤协同创新中心

中药对肺癌细胞凋亡诱导基因表达的影响*

丁明明1,2，吴勉华1,2△

1南京中医药大学，江苏 南京 210029；

2江苏省中医药防治肿瘤协同创新中心

从诱导肺癌细胞凋亡基因、中药单体及复方诱导肺癌细胞凋亡的相关进展方面入手探讨目前以细胞凋亡为研究手段，对肿瘤的发生发展机制、浸润转移、治疗手段及肿瘤细胞的抗药性等问题进行的广泛研究，并取得了一定的进展。

肺癌；细胞凋亡；凋亡基因；中药单体及复方

在全世界范围内，肺癌是一种极为常见且恶性程度较高的肿瘤，超过一半的患者在确诊时已处于肿瘤的中晚期，造成了肺癌的高病死率［1］。只有更好地了解肺癌的发生发展机制和生物学特点，才有助于找到更为有效的途径与方法治疗肺癌，降低其病死率。与其他许多癌症类似，越来越多的研究发现肺癌的发病也可能由癌基因的激活，或抑癌基因的失活导致［2］。因此，针对特定基因的靶向治疗已成为目前肺癌研究的热点和重点。

细胞凋亡(apoptosis)又称程序性细胞死亡(programmed cell death，PCD)，是个体发育过程中基因调控下的细胞自杀活动，是多细胞有机体为调控机体发育、维护内环境稳定，由基因编码的细胞主动死亡过程，是生命体适应环境而生存的一种重要机制［3］。迄今为止，细胞凋亡的分子机制尚未完全阐明，但近年科研人员以细胞凋亡为研究手段，对肿瘤的发生发展机制、浸润转移、治疗手段及肿瘤细胞的抗药性等问题进行了广泛的研究，并取得了一定进展。本文拟对近年诱导肺癌细胞凋亡基因、中药单体及复方诱导肺癌细胞凋亡的相关进展进行综述。

1 肺癌细胞诱导凋亡基因

1.1 半胱天冬氨酸酶(cyst ei ne prot ei nases w i t h speci fi ci t y for aspart i c aci d resi dues) Caspase家族是一组在细胞凋亡中发挥重要作用的效应蛋白，其中以caspase-3为关键分子，在凋亡信号传导的多个途径中发挥功能［4］。目前研究揭示caspase可能在以下几方面发挥作用：1)切断核内板，引起核内板裂解、染色体凝集；2)破坏ICAD(inhibitor of CAD)，活化CAD(Caspase-activated deoxyribonuclease)，使核内DNA片段化［5-6］；3)切断一些参与细胞骨架调节和细胞黏附的蛋白，使得凋亡细胞容易分散，利于被吞噬和消化。由于分子生物学技术的发展，人们对细胞凋亡过程有了更进一步的认识，但凋亡过程的确切机制尚不完全清楚，现已公认细胞凋亡后期的共同途径是caspase的激活。

1.2 Bcl-2蛋白家族 Bcl-2家族由抑制凋亡基因bcl-2、bcl-XL、bcl--W、A1／Bfl-1、Nr13、mcl-1等及促进凋亡基因 bax、Bik、Bad、bid、Hrk、bcl-Xs、bim、mtd等组成［4］。Bcl-2可能在几个方面发挥细胞凋亡作用：调节内质网和线粒体中钙平衡，以避免线粒体中钙超载而致凋亡［7］；通过抑制线粒体释放细胞色素C，从而抑制细胞凋亡；抑制Smac/DIABLO的释放［8］。

1.3 凋亡蛋白激活因子1(A popt ot i c prot ease act i vat i ng fact or 1，A paf-1) 目前已纯化得到3种Apaf蛋白。分别为Apaf-1、2和3。其中Apaf-3就是caspase-9。它和CED-3具有类似的结构。Apaf-1在哺乳动物中的同源蛋白被称作CED-4，在有dATP存在的条件下，能激活procaspase-3。Apaf-2是Apaf-1的共因子，即细胞色素C，它们能结合在一起共同激活caspase-9。从而发挥细胞凋亡调节功能。

1.4 p53抑癌基因 p53基因是目前为止发现与人类肿瘤相关性最为密切的基因。研究发现引起肿瘤形成或细胞转化的p53蛋白是p53基因突变的产物，是一种肿瘤促进因子，它可以消除正常p53的功能，而野生型P53基因是一种抑癌基因，它的失活对肿瘤形成起重要作用。p53蛋白还广泛分布于线粒体、核仁等结构，并且与细胞骨架有相互作用。

1.5 结合基序蛋白5(RN A bi ndi ng m ot i f prot ei n 5，RBM 5) 新近发现的RBM5基因主要分布于细胞核，参与多个基因的 RNA翻译调控，与细胞周期及增殖调控密切相关［9］。RBM5最重要的特征是调控促细胞凋亡的过程。研究发现NSCLC组织中RBM5的表达显著低于癌旁正常组织，提示RBM5与肺癌具有一定关系［10］。其作用机制可能为以下几点：增强TRAIL、Fas、TNF-α介导的细胞凋亡作用；调节caspase-2剪接亚型以及FLIP的促凋亡/抗凋亡比例，刺激促凋亡分子的合成；RBM5能上调促凋亡基因Bax的表达、下调抗调亡基因BCL-XL的表达［11-15］。黎萍等[16]以人肺腺癌细胞A549及其顺铂耐药细胞株A549/DDP为研究对象，以RBM5为靶点，采用流式细胞术、半定量RT-PCR、Western blotting法检测人肺腺癌细胞A549及其耐药细胞 A549/DDP中RBM5的mRNA及蛋白表达水平。揭示RBM5能够通过调控凋亡相关基因的表达，使细胞呈现促凋亡效应；而其低表达可能有助于A549/DDP细胞逃避顺铂诱导的凋亡，参与A549/DDP细胞顺铂耐药。

1.6 基质相互作用因子1(St rom ali nt eract i on m ol ecul e 1，STIM 1)和O rai l STIM1最早被认为是一种肿瘤抑制基因，可抑制多种肿瘤细胞的增殖。Orail是定位于质膜上的四次跨膜蛋白，是钙池调控钙内流(Store-operated calcium entry，SOCE)的两个关键分子。STIM1是胞内钙库Ca2+的传感器，主要位于内质网上，钙库排空后，STIM1可能在内质网上进行重新分配，并移向质膜，将信号传递给质膜上Orail蛋形成斑点状结构，通道打开，细胞外Ca2+内流，形成SOCE的经典过程。林丹苗［17］在姜黄素诱导人非小细胞肺癌 A549细胞凋亡的试验中发现 STIM1和Orail干扰后细胞凋亡率上升，STIM1和Orail过表达后细胞的凋亡率下降。从而进一步证明STIM1和Orail通过自身表达量的改变参与姜黄素诱导的非小细胞肺癌A549细胞凋亡。

1.7 Li vi n异构体 Livin是人类凋亡抑制蛋白家族新成员，包括不同抗凋亡功能的两种异构体Livin α和β，能在胚胎组织和肿瘤组织中表达。它们是IAP家族的新成员，具有与Survivin相似的结构(只有一个BIR结构域)和相似的肿瘤组织表达谱，然而Livin有其独特的作用机制［18］。孙建国［19］收集临床48例NSCLC手术切除标本，采用 RT-PCR和 western blotting方法检测肺癌组织及两种肺腺癌细胞株中Livin基因的表达情况，分析其与肿瘤病理分型、术前放化疗之间的关系；并运用RNA干涉(RNA interference，RNAi)技术进行Livin异构体基因沉默诱导NSCLC细胞凋亡研究。最终得出Livin基因检测有助于肺癌的诊断和组织分型；化疗药物和放射线杀伤癌细胞的同时，癌细胞合成表达 Livin产生凋亡耐受；两种Livin基因异构体(α和β)均具有对化疗药物和放射线诱导癌细胞凋亡的抗性作用，Livin α对多数化疗药物的抗药能力强于Livin β，并具有更强的抗放射诱导凋亡的作用；RNAi技术有效阻断Livin基因表达，诱导肺癌细胞自发凋亡增加，肺癌细胞对化疗药物和放射线的敏感性增强。

1.8 Let-7家族 let-7是最早在线虫中发现的一个保守的mi-RNA家族成员，此家族包含11个成员，拥有共同的种子序列，能作用于Ras、HMGA2、c-myc、caspase3等。通过调控let-7在肿瘤细胞中的表达，可以调节细胞内多种关键分子，进而作用于多种信号通路影响肿瘤细胞的增殖、凋亡、转移等多种生物学行为。魏辉等［20］通过重组pGenesil-let-7a质粒，分别导入人肺鳞癌细胞系KUM-LK2、肺腺癌细胞系A549、小细胞肺癌细胞系H446，之后通过Western blotting检测let-7下游靶基因的表达变化，探索let-7通过MAPK信号转导通路。研究结果证实，转染let-7a后，let-7a在实验组肺癌细胞内的表达明显增高，显著高于转染空质粒的对照组肺癌细胞；West-ern-blot结果证实，在各类型的肺癌细胞中，let-7a作用于Ras，抑制了p-Ras的表达，进而抑制p-ERK的表达，调控 MAPK信号转导通路；对总Ras及总ERK表达抑制较小，证明磷酸化的蛋白在信号转导中的作用。

1.9 性别决定区域Y基因2(Sex det erm i ni ng regi on Y-box 2，SO X 2) SOX2参与维持胚胎干细胞的多能性，并且在多种器官发育过程中发挥作用，包括参与肺支气管的形成［21］。在肿瘤基因表达的研究中，分析其在发育和分化中激活的基因，结果表明，SOX2在低分化的肿瘤中高表达［22-23］。陈思［24］对沉默 SOX2分子及相关癌基因，运用基因芯片技术、体内成像系统、凋亡蛋白芯片分析、实时定量PCR、Western Blotting、流式细胞术等技术观察人肺癌细胞A549和H460凋亡及相应癌基因、凋亡相关信号通路表达情况。认为SOX2在肺癌发生和凋亡信号通路中具有重要作用，并且可与Survivin共同作为标志物应用于肿瘤诊断；SOX2是通过调控肺癌侧群细胞中的癌基因表达进而起到调控肺癌发生作用；SOX2调节肺癌细胞凋亡的分子机制是通过调控RAS-MAP4K4-Survivin这一下游信号通路来实现的。

2 中医药诱导肺癌细胞凋亡相关研究

目前化放疗治疗肺癌效果不理想，且治疗相关毒副作用大，如何延长肺癌患者的生存期、提高患者的生存质量，已成为防治肺癌的最重要课题。中医药因其毒副作用小、作用靶点多等优势，在现代肿瘤治疗过程中的作用越来越突出。国内外一系列研究证明中药单体及复方对稳定瘤体、消除亚临床病灶、提高术后中位生存期有较好作用。目前关于中药诱导肺癌细胞凋亡研究方法主要集中于以下4方面：1)诱导肺癌细胞的生物学特性改变，包括形态学特征变化、生化特征变化等；2)通过细胞周期的阻滞来诱导肺癌细胞凋亡；3)对调控基因及凋亡相关酶的调节从而诱导肺癌细胞凋亡；4)干预相关信号通路来诱导肺癌细胞凋亡［25］。现就中药单体及复方调控基因诱导肺癌细胞凋亡的相关研究进行简单概括。

2.1 中药单体作用肺癌细胞凋亡诱导基因的研究 由于中药单体具有成分单一、研究手段比较简单、化学作用明确、凋亡途径清晰等特点，对中药单体的研究不仅有助于筛选抗肿瘤药物，更能进一步发现新的凋亡途径及诱导方式。目前对中药单体的研究较为广泛，技术较为成熟。孟程等［26］使用姜黄提取物姜黄素诱导肺癌细胞凋亡，发现姜黄素可通过活化NF-KB，上调caspases蛋白，活化的capsase-3，抑制凋亡相关蛋白Survivin的表达，抑制丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路，调节Blc-2家族相关基因蛋白表达等方式诱导肺癌细胞凋亡。栾虹等［27］从中药青风藤中提取青藤碱诱导肺癌NCI-H460细胞凋亡，经SIN干预4、16、24小时后NCI-H460细胞blc-2表达水平逐渐降低，而Bax的表达则呈相反趋势，提示SIN可通过改变细胞增殖和凋亡信号的平衡，促进肺癌细胞的凋亡。黄恺飞等［28］通过观察黄芩素对肺癌细胞A549增殖、凋亡的影响，发现黄芩素明显诱导肺癌细胞A549凋亡，同时明显抑制凋亡相关蛋白blc-2、Survivin蛋白的表达，提升Bax蛋白的表达。

2.2 中药复方诱导肺癌细胞凋亡相关基因的研究 肺癌发病过程复杂，可累积多系统、多器官，涉及多种凋亡通道、诱导途径。相对于中药单体成分单一、研究手段简单，中药复方诱导肿瘤细跑凋亡，对癌基因调控有多因素、多层次、级联作用的特点，对基因表达的调控进行干预、影响，调节基因表达水平［29］。中药复方的研究必然会成为今后诱导肿瘤细胞凋亡的趋势与热点。宣丽华等［30］给荷瘤小鼠外敷温经膏(蟾酥、川乌头、草乌头、白芥子、冰片)，发现温经膏有恢复抑癌基因p53功能的作用，提示其诱导肺癌细胞凋亡正是由于恢复抑癌基因p53所致。蒋宇光［31］在金安粉(苦参碱、氧化苦参碱、黄芪多糖、川芎嗪)诱导肺癌细胞凋亡的相关实验中发现，金安粉可通过P53-Survivin途径提高caspase-3的mRNA转录及caspase-3蛋白的表达，在基因及蛋白水平同时提高损伤性机制，从而诱导细胞凋亡。金安粉诱导A549、H446肺癌细胞株凋亡与影响Survivin基因的通路有关。

3 讨论

细胞凋亡目前是生命科学研究最前沿、最活跃的领域之一。现阶段对肿瘤及抗肿瘤药物的研究已逐渐转向细胞凋亡领域。近年来，随着相关技术的成熟与完善，如基因芯片技术、RNA干涉(RNA interference，RNAi)基因沉默，为研究细胞凋亡提供了新的思路与方法。另外中药抗肿瘤的研究也从早年的中药单体观察逐渐向复方诱导凋亡方向转变。对一些名老中医的经验效方的研究日趋成熟。但目前的研究还存在一些问题，如：1)中药诱导细胞凋亡的研究大量为体外研究，体内试验基本没有，体内代谢环境与体外环境毕竟存在差别，要将研究的药物推广到临床。取得实际的临床和社会效益还有较大距离；2)中药复方的制备仍然欠规范化，将直接影响相关研究的真实性，为相关研究带来负面影响；随着生物科学技术的不断发展、中医药抗肿瘤作用研究向分子水平和基因水平的不断深入，将会有更多具有抗肿瘤细胞凋亡的中药被开发，并运用于临床，为肿瘤患者带来福音。

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Impact of Materia Medica on the Expressions of Apoptosis Induced Gene of Lung Cancer Cells

DING Mingming1,2,WU Mianhua1,2△
1 Nanjing University of Chinese Medicine,Nanjing 210029,China；
2 Jiangsu Provincial Coordination and Innovation Center of TCM Preventing and Treating Tumor

The paper is discussing the pathogensis,infilitration and metastasis of tumors,,therapeutic measures and tumor cells resistance to drugs widely from the progress of gene induced lung cancer cells apoptosis,TCM monomer and compound inducing lung cancer cells apoptosis by taking cellular apoptosis as the research methods, simultaneously,it summarizes the progress of the study.

lung cancer;cell apoptosis;apoptosis gene;TCM monomer and compound

R734.2

A

1004-6852(2015)05-0142-04

2014-09-24

国家自然科学基金项目(编号81473608)；国家自然科学基金项目（编号81273717）。

丁明明(1987—)，男，在读硕士研究生。研究方向：中医内科肿瘤学。

△通讯作者：吴勉华(1955—)，男，教授，主任医师，博士研究生导师。研究方向：肿瘤内科学。