大鼠炎症牙髓中钠离子通道Nav1.7的表达

李 炯 蒋 勇

·基础研究·

大鼠炎症牙髓中钠离子通道Nav1.7的表达

李 炯 蒋 勇

目的 探讨大鼠炎症牙髓中钠离子通道Nav1.7的表达。方法60只SD大鼠分为正常组(A组)和炎症组，炎症组中，封脂多糖(LPS)1 d为B组、3 d为C组、5 d为D组。炎症组通过置入LPS诱导产生牙髓炎。通过HE染色观察各组大鼠牙髓组织病理学改变，通过免疫组化和ELISA检测各组大鼠牙髓中Nav1.7的表达。结果各组牙髓组织病理学发生改变，各组牙髓切片中均有Nav1.7的表达。ELISA结果显示，4组牙髓中Nav1.7的表达量分别为(3.38±0.10)、(3.67±0.15)、(4.04±0.14)和(4.25±0.11)μg/L，各组间差异有统计学意义(P<0.05)。结论Nav1.7的表达增高可能与牙髓炎症具有潜在关联性。

大鼠；炎症；牙髓炎；Nav1.7

Nav1.3、Nav1.6、Nav1.7、Nav1.8、Nav1.9与疼痛的关系密切[1]，尤以Nav1.7亚型与人类疼痛的联系最为紧密。 目前，钠离子通道亚型和口腔颌面部疼痛关系的报道日益增多，因而研究口颌面部疼痛和钠离子通道亚型表达的关系成为热点。本研究通过免疫组化和ELISA对Nav1.7在大鼠正常牙髓和炎症牙髓组织中的表达进行了定性、定量分析，探究Nav1.7的表达与牙髓炎症的关联性，为治疗牙髓炎伴发疼痛提出新的研究方向。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 SD大鼠，体质量300～350 g，雄性，清洁级，由安徽医科大学实验动物中心提供。所有大鼠牙列完整，咬合关系正常，无龋坏，无牙周病，无牙齿畸形。

1.1.2 实验药品、试剂 兔抗Nav1.7多克隆抗体购自美国Anbobio公司；即用型免疫组化ElivisionTMplus 广谱试剂盒购自福州迈新生物技术有限公司；DAB显色试剂盒购自北京中衫金桥生物技术有限公司；大肠杆菌内毒素购自美国Sigma公司；ELISA检测试验盒购自上海源叶生物技术有限公司。

1.2 方法

1.2.1 动物分组和模型制备 参照相关研究[2，3]，60只SD大鼠，随机分为正常组(A组)和炎症组。炎症组中，封LPS 1 d为B组、3 d为C组、5 d为D组。每组各15只实验大鼠，饲养于动物房，喂食硬质鼠料，饲养环境安静，室温在20℃左右，适应性饲养1周后进行实验。大肠杆菌内毒素,用生理盐水稀释为浓度为5 μg/μL的溶液，备用。实验组大鼠称重，10%水合氯醛腹腔麻醉，取其仰卧位，上颌及四肢固定于鼠板上。75%酒精消毒大鼠上下颌前牙区，10#金钢砂球钻切断牙冠，暴露穿髓点，将浸润有内毒素脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)的纸尖置于穿髓点，玻璃离子暂封，正常环境下软食饲养。各组大鼠在相应时间处死，分离上下颌切牙。每组中5只大鼠牙髓标本用于牙髓切片常规HE染色，5只大鼠牙髓标本用于免疫组织化学分析Nav1.7的表达，5只用于ELISA法检测Nav1.7的表达。

1.2.2 一般情况观察 为确保大鼠牙髓炎模型造模成功，仔细观察大鼠的动物行为。每隔3 h对大鼠行为进行观察，观察大鼠在进食量、添足、嘶叫等行为上是否发生改变，并用热牙胶刺激大鼠的患牙，观察是否出现甩头等现象。

1.2.3 牙髓切片制备 麻醉后的大鼠用预冷的4%多聚甲醛行心脏灌流，灌流结束后，立即取上下颌前牙，4%多聚甲醛固定48 h，自来水流水冲洗数小时，PBS 漂洗20 min。然后组织入10%EDTA脱钙液，3～4 d更换1次脱钙液，40 d左右至骨组织变柔软为止。酒精脱水，二甲苯透明，浸蜡，包埋。载玻片先进行防脱处理；Leica切片机切片、裱片、烤片、待用。

1.2.4 牙髓切片HE染色 石蜡切片常规脱蜡至水；苏木精染色10 min，将细胞核染成蓝色，自来水洗去浮色；分色数秒；蓝化；复制伊红染色10 s左右，将细胞质染成红色；分色；干燥；封片；观察。

1.2.5 免疫组织化学 石蜡切片常规脱蜡至水；PBS洗3次，每次3 min；滴加3% H2O2，37℃静置15 min；PBS洗3次，每次3 min；微波修复，高火5 min，冷却5 min，重复1次；PBS洗3次，每次3 min；滴加Ⅰ抗(1 ∶100稀释)50 μL/片，4℃过夜；4℃过夜后需在室温复温20 min；PBS洗3次，每次5 min；滴加HRP标记Ⅱ抗工作液50 μL/片，37℃ 20 min；PBS洗3次，每次5 min；DAB显色1～5 min，在显微镜下掌握染色程度；自来水冲洗；苏木精复染2 min；自来水冲洗10～15 min；脱水、透明、封片、烤片、显微镜拍照。

1.2.6 ELISA法 4组大鼠在预定的时间点脱颈处死，取出牙髓标本置于-80℃冰箱速冻保存。参照ELISA检测试验盒说明书操作步骤,采用双抗体夹心法酶联免疫吸附试验检测各组大鼠牙髓组织中Nav1.7的表达。

2 结果

2.1 牙髓切片HE染色 A组牙髓切片可见排列紧密的成牙本质细胞靠近牙本质内层，牙髓内有大量牙髓细胞，细胞呈星形，核染色深，胞浆淡染、均匀，在牙髓间质内有血管、神经，见图1A。B组牙髓切片可见牙髓组织大致正常，血管轻度扩张，有部分中性炎细胞浸润，牙髓中纤维组织排列轻度紊乱，有少量红细胞，见图1B。C组牙髓切片可见血管中度扩张，有多数中性炎细胞浸润，牙髓中纤维组织排列中度紊乱，血管扩张变形明显，血管腔内可见红细胞，见图1C。D组牙髓切片可见牙髓中纤维组织排列重度紊乱，部分纤维组织消融，血管重度扩张，血管腔内有大量红细胞，见图1D。

2.2 免疫组织化学 Nav1.7免疫组化结果显示各组大鼠牙髓切片可见棕黄色或褐色阳性表达。A组牙髓切片中Nav1.7阳性表达几乎没有，见图2A。B、C、D组中Nav1.7的阳性表达随着时间和炎症的增加呈升高，见图2B、2C、2D。

2.3 ELISA法 大鼠牙髓组织中均有Nav1.7的表达，Nav1.7平均光密度与含量随着炎症时间的增加而升高。4组间大鼠Nav1.7含量差异有统计学意义(F=48.231,P=0.000)，两两比较，差异均有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 各组大鼠牙髓切片中Nav1.7表达

3 讨论

当牙髓发生急性炎症时，随着血管扩张、充血，炎症细胞浸润，血管通透性增加，髓腔内的压力会明显增高，从而压迫神经纤维而引发疼痛[4]。牙痛是神经痛中常见的一种，神经性疼痛产生的主要原因是神经元的异常兴奋，在这种痛敏过程中，电压门控钠离子通道起了关键性的作用。本研究通过LPS制备大鼠牙髓炎模型，通过HE染色、免疫组织化学和ELISA法定性、定量研究各组大鼠Nav1.7的表达。

Byers等[5]发现Nav1.1～Nav1.9在大鼠各个生命阶段的不同部位的成牙本质细胞细胞膜上均有表达，且电压门控钠通道可能参与了感受刺激的过程，本研究与上述研究结果相符。本实验正常组和炎症组中Nav1.7均有表达，且Nav1.7表达随炎症天数的增加而升高，免疫组化和ELISA法实验结果显示各组之间均有显著差异性。

本实验研究的Nav1.7主要表达在外周感觉神经元上，介导快激活快失活的TTX-S电流。Nav1.7能在较弱的刺激下允许钠离子持续内流，提高神经元的去极化水平，可将最初的疼痛电信号放大并促使神经元持续兴奋，在外周神经性疼痛和炎性疼痛通路中发挥重要作用[6]。另外，Ichikawa等[7]通过膜片钳在培养的人成牙本质细胞检测到电压依赖性钠通道，提示钠通道在通道受体信号相互作用和膜电位调控所驱动的细胞功能中起到了重要作用。上述研究均显示钠离子通道可能作为中介传递了成牙本质细胞和牙本质小管流体流动之间的信号，参与了牙痛的感觉发生过程。

本研究Nav1.7的表达量和炎症程度呈正相关，即炎症组Nav1.7的表达随着炎症程度增强而升高，这可能与炎症介质的作用有关。前列腺素、缓激肽、自由基、阳离子和神经生长因子的释放，增加了VGSCS的表达，并且表现为原发性痛觉致敏[8]。前列腺素E2、5-羟色胺、腺苷、肾上腺素、内皮素和神经生长因子可以通过包括PKA、PKC在内的第二信使通路，导致钠离子传导速度快速上升、电压依赖性激活曲线向超极化移动和加速TTX-R钠电流产生，从而增强神经元的兴奋性，导致伤害感受器敏化和痛觉致敏[9]。

本研究正常组和炎症组Nav1.7均有表达。因此，如果本研究能通过电生理和膜片钳技术，记录分离的牙髓细胞与神经元中施加牙髓炎相关炎症介质和钠通道阻滞剂，前后Nav1.7的电流密度、通道开闭时程、电流振幅及动作电位的变化，将更进一步揭示牙髓炎痛觉致敏模型中Nav1.7与疼痛的关系。

通过本研究，发现牙髓炎的疼痛可能与Nav1.7的表达升高有潜在关联，但口颌面部疼痛的发生是一个复杂过程，Nav1.7仅仅可能做为一个参与因素，具体牙髓炎致敏的痛觉传导机制有待进一步研究。

[1] Dib-Hajj SD,Yang Y,Black JA,et al.The Nav1.7 sodium channel:from molecule to man[J].Nat Rev Neurosci,2012,14(1):49-62.

[2] 顾斌,刘洪臣,郭宏,等.大鼠急性牙髓炎动物模型的建立[J].中华老年口腔医学杂志，2009,7(5):304-307.

[3] Esmaeili A,Akhavan A,Bouzari M,et al.Temporal expression pattern of sodium channel Nav1.8 messenger RNA in pulpitis[J].Int Endod J,2011,44(6):499-504.

[4] 卢伟,张红,韩东.3种方法对于控制急性牙髓炎疼痛的比较研究[J].安徽医学,2012,33(2)：167-169.

[5] Byers MR,Westenbroek RE.Odontoblasts in developing,mature and ageing rat teeth have multiple phenotypes that variably express all nine voltage-gated sodium channels[J].Arch Oral Biol,2011,56(11):1199-220.

[6] Levinson SR,Luo S,Henry MA.The role of sodium channels in chronic pain[J].Muscle Nerve,2012,46(2):155-165.

[7] Ichikawa H,Kim HJ,Shuprisha A,et al.Voltage-dependent sodium channels and calcium-activated potassium channels in human odontoblasts in vitro[J].J Endod,2012, 38(10):1355-62.

[8] Esmaeili A,Akhavan A,Bouzari M,et al.Temporal expression pattern of sodium channel Nav1.8 messenger RNA in pulpitis[J].Int Endod J,2011,44(6):499-504.

[9] Mamoru T,Shigeji M,Barry J,et al.Peripheral and central mechanisms of trigeminal neuropathic and inflammatory pain[J]. J Oral Biosci,2011,53(4):318-329.

(2014-11-18 收稿 2015-03-20 修回)

Expression of voltage gated sodium channel Nav1.7 in rat pulpitis

LiJiong,JiangYong

StomatologicHospital&College,AnhuiMedicalUniversity,KeyLabofOralDiseasesResearchofAnhuiProvince,Hefei230032,China

Objective To investigate the expression of voltage gated sodium channel Nav1.7 in rat pulpitis. Sixty rats were randomly divided into a nontreatment group(A)and three inflammation groups: day1(B), day3(C) and day5(D), and pulpitis was induced by creating pulp exposures to LPS in rat incisions. Histopathological changes and the expression of Nav1.7 were observed by Hematoxylin-eosin staining, immunohistochemistry and ELISA(Enzyme-linked immunosorbent assay) in each team.ResultsHistopathological changes were revealed in each team, while Nav1.7 was also expressed. ELISA results revealed that the level of Nav1.7 in control pulp tissue was (3.38±0.10) μg/L, in painful pulp tissue of 1d group was(3.67±0.15)μg/L, in painful pulp tissue of 3d group was(4.04±0.14)μg/L and in painful pulp tissue of 5d group was(4.25±0.11)μg/L(P<0.05).ConclusionThe relationship between dental pain and Nav1.7 expression level maybe exist.

Rats;Inflammation;Pulpitis;Nav1.7

安徽医科大学校基金课题(项目编号：2012xkj022)

230032 合肥 安徽医科大学附属口腔医院，安徽医科大学口腔医学院，安徽省口腔疾病研究中心实验室

10.3969/j.issn.1000-0399.2015.06.001