常温与高温嗜油微生物的异同比较分析

常温与高温嗜油微生物的异同比较分析

李琳，罗明志，周远群，徐文硕，张强，邱国华，邓林红*

(常州大学 生物医学工程与健康科学研究院常州市呼吸医学工程重点实验室，江苏 常州 213164)

摘要：石油污染的环境中存在可以降解石油烃的微生物.比较了高温微生物(包括嗜油菌)和常温微生物在菌体细胞的形态、结构、生理生化的性质、DNA(基因组)和蛋白质(蛋白质组)等方面的异同，并总结了一些高温微生物可能的适应机制，以期有助于进一步提高高温嗜油菌的应用潜力.

关键词：高温微生物；常温微生物；嗜油菌

中图分类号：Q932文献标志码：A

文章编号：1008-5564(2015)03-0047-03

收稿日期：2015-02-03

基金项目：小麦精准量化栽培技术研究及示范推广项目(NC1306)

作者简介：张选厚(1964—)，男，陕西蓝田人，陕西省西安市农业技术推广中心研究员，主要从事作物高产栽培技术研究与推广.

ComparativeAnalysisonSimilaritiesandDifferencesofOilMicroorganismsatNormalandHighTemperature

LILin,LUOMing-zhi,ZHOUYuan-qun,XUWen-shuo,ZHANGQiang,QIUGuo-hua,DENGLin-hong

(ChangzhouKeyLaboratoryofRespiratoryMedicalEngineering,InstituteofBiomedicalEngineeringand

HealthSciencesofChangzhouUniversity,Changzhou213164,China)

Abstract：Microorganisms that can degrade petroleum hydrocarbons exist in the petroleum pollution environment.In this paper, similarities and differences of morphology, structure, physiological and biochemical properties, DNA (genome) and proteins (proteomics) of bacterial cells were compared for high temperature microorganisms (including oil bacteria) and normal temperature microorganisms, and some possible adaptation mechanisms of high temperature microorganisms were summarized to improve the potential application of oil bacteria at high temperature.

Keywords：hightemperaturemicroorganisms;normaltemperaturemicroorganisms;oilbacteria

石油微生物在石油开采和含油污水的处理领域具有重要意义[1].在石油开采方面，传统的物理及化学采油方法缺点较多，如工艺复杂、成本高以及污染严重，特别是采收率低,仅60%～70%以上的原油在开采后仍残留于油藏中无法开采，这些残留的主要成分是重质原油[2].嗜油菌可以使原油的组分和性质发生变化(轻质组分增加、粘度下降)，从而改善原油的流动性；嗜油菌还可以产生有机溶剂、表面活性剂、酸和气体等驱油物质，提高驱油效率，从而提高原油的采收率.

微生物也被广泛用于含油污水的处理.在采油、炼油、贮油及运输等过程中产生大量含油污水，如果不加处理直接排入河流、湖泊或海湾，会对人类、动物和植物以及整个生态系统产生严重危害，影响工业、农业、畜牧业、养殖业和旅游业发展.尤其是石油中含有致癌烃，可被鱼、贝富集并通过食物链危害人体健康[3].

目前，含油污水的处理方法很多，包括物理、化学和生物(如嗜油菌)等方法.其中嗜油菌方法费用低、效率高，而且所能处理的污染物阈值低、残留少，被视为一项具有广阔前景的高新技术，是目前环境科学研究的热点[4].

在土壤和水体中存在着大量能够降解石油烃类化合物的微生物[1,4]，目前已分离多个属的细菌可利用原油或原油的某一组分为唯一碳源生长，特别是在受油污染的水和沉积物中(比未受污染地区高出1～2个数量级)，有70多个属，140余种，包括细菌、放线菌、霉菌、酵母等，较为常见的有红球菌属[5]、假单胞菌属[6]、不动杆菌属[6]、无色杆菌属、产碱杆菌属、节杆菌属、芽孢杆菌属、黄杆菌属、棒杆菌属、微杆菌属、微球菌属、放线菌属、诺卡氏菌属、分枝杆菌属等等；真菌有：曲霉属、毛霉属、镰刀霉属、青霉属、木霉属和被孢霉属；酵母菌有假丝酵母属、红酵母属、球拟酵母属和酵母属[7].

但这类常温石油降解菌的最适温度一般是15～50℃[8-9]，无法满足更高温度的要求，如沙漠土壤、半干旱的炎热地区的油田和更深更热的油井，以及高温含油污水的处理等，因此很多学者开始研究降解石油的高温菌，其最适温度一般在50～80℃之间，有的甚至能达到100℃以上[9].高温菌可以分离自火山岛[10]、草堆、煤堆、温泉、地热区土壤以及高温油田原油样品和油层采出水[11].目前已报道的有嗜热嗜油杆菌属[12]、热微菌属、芽孢杆菌属、地芽孢杆菌属、栖热菌属、嗜热古细菌、硫矿硫化叶菌、嗜热细菌中的海栖热袍菌等.目前，在石油污水处理中应用较多的是常温嗜油菌，但在实际的处理过程中却遇到了一些问题.比如在污水处理工艺中，原油经过三相分离之后的含油污水温度为50～60 ℃，所以要在用常温微生物进一步降解之前，将含油污水进行降温，这就消耗了大量的电能，同时会将污水中的芳香烃等致癌物质吹入空气中，严重污染空气.直接对高温污水进行微生物降解处理就变得更为急迫和重要.

目前，已有不少有关高温嗜油菌的分离、筛选和鉴定等研究工作的报道，但也存在一些实际应用的问题.本文首先总结了常温和高温嗜油菌在降解石油方面的共同点，然后从细胞形态特征、生理生化特性、分子水平以及蛋白质组和基因组等方面分析了常温菌和高温菌，特别是常温和高温嗜油菌之间的不同点，为进一步改良高温嗜油菌有效性能提供理论参考.

1嗜油菌降解石油的作用机理及相关因素

嗜油菌将石油组分及其降解物作为主要的碳源和能源[13].嗜油菌产生的表面活性物质先乳化分散油脂形成悬浮于水中的微小油滴；表面活性物质还可降低油滴与嗜油菌细胞壁的表面张力，使微小油滴吸附在嗜油菌的表面，最后进入嗜油菌体内而被分解或积累[3].

在石油烃中，直链烃类易被氧化，芳烃和环烷烃的氧化困难.单末端氧化是最主要的方式[2]，如嗜油菌对正链烷的氧化首先是在单氧化酶系作用下，将氧分子的一个氧原子加入到烃中，使其形成相应的醇，另一个氧原子与烃类脱下的氢结合形成水.正链烷被氧化成相应的醇后，在脱氢酶的作用下，接着被氧化成相应的醛和酸.脂肪酸再通过β氧化和三羧酸循环进一步氧化成二氧化碳和水[3].

对难降解的有机物，需要有多种酶和/或多种微生物的参与，其中的一种酶或微生物的产物可以成为另外一种酶或微生物的底物，形成降解链.在高温条件下，原油本身的粘度相对于低温或常温下较低，更有利于石油降解.

参与降解有机物的催化反应过程的酶多为诱导酶[14].通过对铜绿假单胞菌种烷烃代谢途径的研究发现几种酶能够同时被诱导合成，实现短链烷烃的氧化作用，产生相应的醛和脂肪酸[15].

嗜油菌代谢的功能还可以通过同种或不同种微生物之间的遗传物质的转移而实现的，随着嗜油菌降解酶的基因在环境中的扩散转移，嗜油菌对难降解有机物的降解能力也逐渐加强，遗传物质在嗜油菌种群间的转移是嗜油菌对难降解有机物的适应并利用的一种主动机制(嗜油菌的驯化过程).

2细胞表层结构

高温菌内的所有物质(脂类、核酸和蛋白质等大分子)都必须耐热，才能够维持细胞的正常生长和增殖[16].这就要求它们有一些特殊的成分和/或形成特殊的结构.

细胞壁是细菌的基本结构，是细胞表面的坚硬外壳，保护细胞免受损伤和渗透溶解[17].在一些极端条件如高温中生长的微生物中，其细胞表面通常会覆盖一些特殊的结构，如嗜热栖热菌的胞壁在电子显微镜下表现为一个复杂的4层结构[18]，其中一层是由聚合糖蛋白单分子有规则排列的蛋白质结构，称为S-层(表面层).此S-层作为外层保护壳，也可作为分子筛和/或细胞胞外酶粘附位点.在细菌中，S-层与肽聚糖或外膜的次生细胞壁聚合物有关.在古细菌中，S-层蛋白被锚定在细胞质膜上形成细胞壁的主要组成部分[18-19].

3细胞膜成分

细胞膜中含有大量的脂类，如糖脂和脂肪酸，它们的种类、结构和含量在常温菌和高温菌之间也不同[2].嗜热古细菌的细胞膜通常含有甘油—醚键，而常温菌细胞膜中含有甘油—酯键.醚键比酯键更稳定，酯键在酸碱和热等条件下更容易降解[20].再如，大肠杆菌在高温下生长时，细胞膜中增加的是饱和脂肪酸的含量，降低的是不饱和脂肪酸的含量.同理，在高温细菌中，长链饱和脂肪酸含量比不饱和脂肪酸的含量高，且随着温度的提高，细胞膜中的长链饱和脂肪酸含量随之继续增加.

当生长温度从40℃提高到60℃时，嗜热脂肪芽孢杆菌细胞膜中的16碳脂肪酸的含量增加了3～4倍，而不饱和脂肪酸含量相应减少.水生栖热菌在50～70℃生长时，其细胞膜中增加最多的是16碳支脂肪酸，而不饱和脂肪酸的含量则降低[20].高温细菌可能是通过细胞膜中长链饱和脂肪酸含量增加来提高机体抗热能力.

增加细胞膜中糖脂的含量也有利于提高栖热细菌的抗高温能力[21].栖热细菌生长75℃时，其细胞膜中总脂含量比50℃时高70%以上，其中糖脂增加了4倍.

由此可以看出，高温微生物能够在高温环境中生长并繁殖，有其独特的适应机制，如：特殊的胞被和细胞膜结构，有不同的细胞膜脂的类型和含量，如异型脂肪酸、稳定型脂肪酸和环烷型脂肪酸等，为耐热菌细胞膜耐受高温提供了有利条件.

4生理生化特性比较

4.1蛋白质比较

高温菌在更高的温度下生长更快，其细胞内的蛋白质和酶抵抗变性的能力更强[10]，这些耐热蛋白与耐热酶的出现，有利于细胞适应高温环境，大大增加了机体的热稳定性，这就是氨基酸的突变适应[2].

对常温和高温菌蛋白质的比较研究后发现，氢键、盐桥、疏水基团之间的相互作用和氨基酸类型、数量被认为是影响蛋白质热稳定性的重要因素.

通过比较12个不同基因组的研究发现，来自高温菌的蛋白质比常温菌蛋白质的氨基酸残基数目少，而且带电氨基酸的含量远高于常温菌.在高级结构中，高温菌中带电氨基酸的距离一般是1～4个螺旋，有较多的盐桥和侧链-侧链之间的氢键，且盐桥的极性方向与螺旋偶极方向一致[22].此外，对高温菌和常温菌之间同源蛋白质序列比较表明，在高温菌的蛋白质中，精氨酸和酪氨酸更频繁，而胱氨酸和丝氨酸在嗜热蛋白质更少[23-24].在系统分析8个高温和12个常温菌完整基因组的可溶性蛋白质序列后，找出了一些影响蛋白质热稳定性的因素，结果发现相对于常温菌来说，高温菌的蛋白质大小降低，增加参与β-链、螺旋和氢键的残基数量，显著增加了带电氨基酸和疏水氨基酸的数量.在嗜热蛋白质中带电荷氨基酸和疏水的β-支链氨基酸含量比常温蛋白质高，而不带电荷的极性氨基酸的含量比常温蛋白质低.由此可见，减小蛋白质长度、增加参与形成氢键的氨基酸残基的数目、通过盐桥稳定螺旋结构、增加β-折叠的比例都可以增强蛋白质的稳定度[25].

另一方面，有研究从高分辨率X-射线晶体结构入手，试图找出高温菌蛋白质的热稳定性的因素.结果显示：(1)在高温菌中，丝氨酸和苏氨酸的灵活性比较低；(2)在高温菌的蛋白质中谷氨酸和赖氨酸的比例高，丝氨酸和苏氨酸的比例低.这些结果反映出高温和常温蛋白质动力学的差异，因此氨基酸替换可能改变蛋白质热稳定性[26].比较高温和常温菌的铁氧还蛋白、3-磷酸甘油醛脱氢酶和乳酸脱氢酶的氨基酸序列，结果表明常温菌中的甘氨酸、丝氨酸、赖氨酸和天冬氨酸在高温菌中分别被丙氨酸、苏氨酸、精氨酸和谷氨酸所取代.这些并不改变蛋白质分子骨架构象的细微变化却增加了蛋白质的耐热性.这种效应是由于增加了蛋白质内部的疏水作用，减少了分子表面的疏水力，同时，丙氨酸增加了螺旋的稳定性[27].

4.2DNA比较

高温细菌的基因组中，G+C含量通常比常温细菌高[28]，DNA的解链温度(Tm)较高[20，29]，嗜热脂肪芽孢杆菌基因的密码子的第三位对G/C有偏爱，有利于高温中保持DNA分子的稳定性，而且高温菌DNA双螺旋结构中氢键的数量大于常温菌DNA的氢键数[30].

线性DNA通过链的分离很容易变性，但环状DNA分子却能够耐受较高的变性温度，因此DNA双链在高温条件下维持其二级结构是完全可能的.而且，无论是正超螺旋还是负超螺旋，都能够进一步增加DNA的解链温度.

特殊蛋白质结合在DNA上可增加遗传物质对抗热变性.例如在嗜热栖热菌中，一个显著特征是罕见的细胞多胺的组合物，除了正常的多胺(腐胺、亚精胺和精)，还有包括长多胺和支链多胺，这在其他细菌中少见[31]，提示这些多胺在高温下的化学反应中的重要作用.据报道，这样的多胺对高温菌的蛋白质合成的是必不可少，有助于30S核糖体亚基、mRNA和起始氨酰tRNA之间形成适当的起始复合物结构[32].多胺也能够有效维持RNA和DNA热稳定性[31-32].极端嗜热菌中tRNA转录后经过相关的修饰有利于适应高温环境，RNA螺旋侧面突起的碱基和近端酯键之间的配对也能够避免结构上的不稳定性[33].

5结语

综上所述，与常温菌相比，高温菌细胞表层具有富含蛋白质的S-层结构；细胞膜中的醚键和长链饱和脂肪酸较多；蛋白质较短、氢键较多、盐桥结构增强、蛋白质内部的疏水作用增加；DNA中G+C含量较高和特殊的多胺等，这些都可能是高温菌的生存策略.

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[责任编辑马云彤]

Vol.18No.3Jul.2015