骨形成蛋白9腺病毒表达载体的构建及鉴定＊

方 芳，张青蓝，杨 孛，鄢国义，朱丹平

（重庆市中医院／重庆市第一人民医院内分泌科 400021）

骨形成蛋白（bone morphogenetic proteins，BMP）属转化生长因子B超家族成员，在众多生命活动中均扮演重要角色。其中BMP9与糖、脂代谢中多个关键转变环节有直接相关性。本课题组前期发现BMP9 基因表达异常可能与2 型糖尿病（type 2diabetes mellitus，T2DM）代谢紊乱及胰岛素分泌缺陷相关，结合Chen等［1］的研究，可推测：BMP9基因表达下降也许是导致T2DM 代谢异常的重要因素之一，增加其基因拷贝，可能使糖、脂代谢紊乱得到一定程度的改善。因此，课题组先行构建BMP-9基因腺病毒表达载体及其稳定的产毒细胞系，为后续观察其对T2DM 糖、脂代谢异常的干预效应奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料 质粒pCMV／BMP9 由Helm GA（University of Virginia Health System）馈赠，质粒pDV60含腺病毒Ad5纤维cDNA 由Nemerow GR 博 士（The Scripps Research Institue，California）馈赠；293细胞系购自上海易莎生物有限公司；脂质体Lipofectamine2000购自Invitrogen公司；EcoRⅠ、BamHⅠ酶购自华美生物工程公司；T4DNA 连接酶购自大连宝生物公司；Ploybrene、FBS均购自Gibco公司；质粒抽提及回收试剂盒购自上海品美公司。

1.2 方法

1.2.1 去纤维腺病毒载体Ad5.BMP9.F构建 质粒pCMV／BMP9与腺病毒载体Ad5.F分别以EcoRⅠ、BamHⅠ双酶切，切胶回收BMP9cDNA 与Ad5.F 线性载体片段，连接、转化后，提取质粒作酶切与测序鉴定。

1.2.2 Ad5.BMP9.F 包装与滴度测 定 Lipofectamine2000介导Ad5.BMP9.F 转 染293 细 胞，以 空 载 体Ad5.F 作 对 照（阴性对照组）；筛选直至肉眼可见抗性细胞克隆形成，挑选分隔良好的细胞克隆扩大培养，收集抗性细胞克隆上清测病毒滴度，留取滴度较高的细胞克隆及病毒原液备用。

1.2.3 腺病毒纤维cDNA 定点突变（F＋） 质粒pDV60含腺病毒Ad5纤维cDNA 采用PCR 体外定点突变（PCR-SDM）法在pDV60上进行定点突变，突变位点S408E、P409A（参见Xia-D 纤维结构定位），致突变引物如下，结果经测序鉴定。正向5′-CGC AGC CTT AAC CTC AGC-3′，反 向5′-GTT GGA GGC AGG CGT AGA-3′。

2 结 果

2.1 BMP9基因重组腺病毒载体鉴定

2.1.1 酶切鉴定 重组腺病毒载体Ad5.BMP9.F 经EcoRⅠ、BamHⅠ双酶切，获得1 290bp的BMP9cDNA 片段，证实BMP9cDNA 已插入载体Ad5.F中且插入位点正确。

2.1.2 测序鉴定 经酶切粗筛正确的重组质粒送生工生物工程公司测序，证实目的基因序列与所赠质粒附注BMP9cDNA序列相同，见图1。

图1 BMP9基因测序图

2.2 病毒滴度测定 脂质体包裹Ad5.BMP9.F 同源重组腺病毒基因组质粒转染293细胞15d后，光镜及荧光显微镜下观察到空斑形成，细胞变圆、肿胀、脱壁，细胞核变大等病变，转染效率90%以上，见图2。用Ad5.BMP9.F感染包装细胞293细胞，约15d可见抗性细胞克隆，平均滴度6.0×105CFU／mL，最高滴度7.4×105CFU／mL。

图2 转染重组Ad5.BMP9.F载体15d后细胞形态变化（×100）

2.3 产毒细胞克隆鉴定 将293／BMP9细胞提取总RNA，逆转录后用检测引物进行PCR，产物电泳于162bp处出现目的条带，但阴性对照组RT-PCR产物电泳无目的条带出现，证明BMP9基因已成功整合与转录。

图3 BMP9基因RT-PCR鉴定

3 讨 论

BMP属转化生长因子β超家族成员，因具强烈的骨诱导活性而受到关注，故目前研究多集中在其与骨疾病的关系及其调控骨再生的应用上［2-3］。而事实上，BMP在众多生命活动中均扮演着重要角色，其能触发神经干细胞向神经原分化、维持肾小管上皮细胞形态、调控造血干细胞数量及平衡内皮细胞存亡等［4-8］。近期，通过高通量功能基因组筛选发现BMP9与糖、脂代谢中多个关键转变环节有直接相关性，提示BMP9 还可能是一种新的糖、脂代谢调节因子［9-10］。Chen等［1］研究表明，BMP9能阻止磷酸烯醇式丙酮激酶（P-enolpyruvate carboxykinase，PEPCK）合成并激活丝／苏氨酸激酶Akt，从而抑制肝内糖异生并促进肌糖原合成以降低血糖；同时，BMP9还能调控苹果酸酶（malic enzyme，ME）与脂酸合成酶（fatty acid synthase，FAS）的转录，这两个酶均为涉及肝脂肪酸代谢的关键酶。BMP9可能通过对这些关键酶的调控而在糖、脂代谢中发挥着重要的调节作用。随后的动物体内、外实验则证实了，BMP9具有部分类似胰岛素的糖代谢调节作用［11］，并与B 细胞的胰岛素分泌直接相关，而糖代谢紊乱与第一时相胰岛素分泌缺陷又是T2DM 的主要特征。前期研究工作中发现在长时间高糖状态下，BMP9基因表达与血糖浓度呈异向变化趋势，与急性胰岛素对葡萄糖反应（AIRg）呈同向变化趋势，提示BMP9基因表达异常可能与T2DM 糖代谢紊乱及胰岛素分泌缺陷相关［12］。结合Chen等［1］的研究可推测：BMP9基因表达下降也许是导致T2DM 代谢异常的重要因素之一，增加BMP9基因拷贝，可能使糖、脂代谢紊乱得到一定程度的改善。

为更好达成上述研究目的，选择高效、稳定的转染载体较为重要。BMP9主要在肝脏表达，然而，腺病毒具有较高的转染效率及一定的亲肝性。而更重要的是，如何进一步提高其肝靶向性？近期研究表明在经典的柯萨奇-腺病毒受体（coxsackie-adenovirus receptor，CAR）／整合素通路以外，腺病毒对肝细胞还有其特异的感染通路，并在腺病毒侵入肝细胞过程中起主导作用［12］。阻断CAR／整合素通路，机体其他部位的基因导入明显下降，在肝脏却没有影响［13］。因此，本研究拟采用PCR-SDM 致5型腺病毒纤维头部的CAR 结合位点突变，由此阻断CAR／整合素通路，此种改良的腺病毒将具有更强的肝靶向性。本研究基于此法成功构建了携BMP9基因的稳定产毒细胞克隆，其最高病毒滴度可达7.4×105CFU／mL。

下一步，课题组拟将BMP9基因在T2DM 鼠体内定向导入肝细胞并特异表达，观察其对T2DM 糖、脂代谢紊乱的干预效应，同时从胰岛素敏感性、激素分泌、酶活性调节及基因转录调控等角度出发，就其作用机制进行探讨，从而为深入理解T2DM 代谢紊乱的发生机制及制订新的治疗策略提供理论与实验依据。

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