三种大鼠肌肉组织蛋白提取方法的比较研究

孟永海，王欣慰，史连宏，康天济，陈忠新，李 冀，翟春梅

(1. 黑龙江中医药大学 北药基础与应用研究省部共建教育部重点实验室，哈尔滨 150040；2. 黑龙江省中药及天然药物药效物质基础研究重点实验室，哈尔滨 150040；3. 黑龙江中医药大学 基础医学院，哈尔滨 150040)

三种大鼠肌肉组织蛋白提取方法的比较研究

孟永海1,2，王欣慰1,2，史连宏1,2，康天济1，陈忠新1，李 冀3，翟春梅1,2

(1. 黑龙江中医药大学 北药基础与应用研究省部共建教育部重点实验室，哈尔滨 150040；2. 黑龙江省中药及天然药物药效物质基础研究重点实验室，哈尔滨 150040；3. 黑龙江中医药大学 基础医学院，哈尔滨 150040)

建立并优化组织蛋白的提取方法.以大鼠肌肉组织为实验材料，分别采用三氯乙酸(TCA)/丙酮沉淀法、改良的TCA /丙酮沉淀法和试剂盒法对其组织蛋白进行提取，对三种方法提取的蛋白进行光密度、聚丙烯酰胺凝胶电泳检测.紫外光谱检测表明TCA/丙酮沉淀法在波长562 nm蛋白含量比较低，而改良的TCA /丙酮沉淀法和试剂盒法的蛋白含量比较高，聚丙烯酰胺凝胶电泳检测证实：常规的TCA/丙酮沉淀法提取的蛋白条带模糊，其他两种方法的提取的蛋白条带很清晰，蛋白没有降解，无拖尾现象.

大鼠；蛋白提取；蛋白定量；聚丙酰胺凝胶电泳

随着蛋白质提取分析技术及蛋白质组学技术的飞速发展，大量的研究工作使人们对蛋白质的作用机制和功能认识逐渐加深.在整个蛋白质研究过程中，蛋白质的提取和分离是最重要的环节.目前，对于组织蛋白的提取方法不断完善和增加，如何丰富和正确选择蛋白的提取方法，需要我们做进一步研究.然而机体中的蛋白质通常具有种类繁多、性质差异大等特性，即使归属于同一类蛋白，提取的方法可能大不相同.因此，如何从大鼠肌肉组织中提取高质量的蛋白显得十分重要和必要.本文分别采用三氯乙酸(TCA) /丙酮沉淀法、改良的TCA /丙酮沉淀法和试剂盒法对其组织蛋白进行提取，对三种方法提取的蛋白进行光密度、聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，试图建立并优化组织蛋白的提取方法，为组织蛋白的大规模提取提供理论基础和实验基础.

1 实验材料与方法

1.1 实验材料

雄性SD大鼠(体重220±20) g，购自黑龙江中医药大学医学实验动物中心，合格证号：SCXK黑2013004，动物笼饲养，保持室内温.温度为18～22 ℃，室内昼夜自然明暗交替照明，饲养标准大鼠饲料.

1.2 实验试剂

SDS-PAGE 凝胶电泳所用试剂为BIO-RAD生化科技有限公司，实验中的其他试剂为国产分析纯.

1.3 实验仪器

UV-1700紫外分光光度计；电泳仪和电泳自动成像仪美国 BIO-RAD生化科技有限公司；电子天平上海人和科学仪器有限公司；MIKRO220R离心机HETTICH；

2 组织蛋白提取方法

2.1 三氯乙酸(TCA) /丙酮沉淀法[1-2]

1) 大鼠肌肉组织0.1 g，用液氮研磨成粉末，全部转移到离心管中.

2) 在蛋白溶液中加入约1/10体积的质量分数大约是10%TCA(含10%(W/V) TCA 和0.07% (V/V)β-巯基乙醇，-20 ℃保存).

3) 高速离心后(12 000 g，离心30 min)弃上清液.

4) 加入400 μL冷丙酮进行洗沉淀，离心后弃去丙酮.

5) 重复第④步骤；15 000 g，离心10 min，倒掉上清.

6) 加入一定量的上样缓冲液溶解沉淀，离心. BCA法定量蛋白，-80 ℃保存备用.

2.2 改良的三氯乙酸(TCA) /丙酮沉淀法[3-4]

在其他条件不变时，采用单因素试验，将三氯乙酸(TCA)/丙酮沉淀法进行改良，在蛋白溶液中加入约1/10体积的质量分数大约是60% TCA震荡混匀，冰浴静置10 min以上，其他步骤不变.

2.3 组织蛋白提取试剂盒法

1)取0.1 g大鼠肌肉组织，用液氮研磨能细末，转入离心管中.

2)取990 μL的蛋白抽提试剂，加入10 μL的蛋白酶抑制剂，蛋白酶抑制剂混合物在进行蛋白抽提前2～3 min内加入.

3)大鼠肌肉组织0.1 g，用液氮研磨成粉末，全部转移到离心管中，加入组织蛋白抽提试剂.

4)冰上孵育20～30 min.

5)10 000×g离心20 min.

6)收集上清，在-80 ℃保存备用.

2.4 蛋白的定量检测和标准曲线的绘制[5-6]

采用BCA(Bicin-choninic Acid)蛋白定量法，具有速度快、灵敏度高、稳定性好等诸多优点.目前，在蛋白定量中应用非常广泛.见表1.

表1 BCA法蛋白定量测定结果

管号1234567牛血清白蛋白量/μg10020020020020020000．9%生理盐/μg0200200200200200200牛血清白蛋白质量浓度/(μg·μL-1)210．50．250．1250．06250

紫外分光光度仪开机预热20 min.分别取出常规法、改良的TCA/丙酮沉淀法和试剂盒法提出的蛋白.取7只灭菌后的试管，进行编号1-7，按上表，将稀释好的1-7 BSA标准品和待测蛋白样品各100 μL分别加到作好标记的试管中.每个测定的样本做3个平行反应.向每个试管中各加入2 mL BCA工作液，充分混匀，室温孵育2 h.将各管冷却至室温.用分光光度计在562 nm处测定每个样品及BSA标准品的吸光值，同时做好记录.分别读取1～7#管的光密度.绘制标准曲线时X轴(纵坐标)为蛋白的质量浓度(μg/μL)，Y轴(纵坐标)为吸光值.用Excel制作标准曲线.计算样品中的蛋白含量.

2.5 十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)检测蛋白的完整性[7-8]

采用双垂直板SDS-PAGE进行分析.分离胶质量分数10%，浓缩胶质量分数5%，凝胶厚度为1 mm，考马斯亮蓝快速染色(G250)方法进行凝胶染色，染色后的凝胶用 BIO-RAD扫描仪进行扫描，重复3 次，并利用Image Lab4.0.1软件进行图像分析.

3 结果与讨论

3.1 不同方法的蛋白含量

为了提高实验的准确性，减少不必要的误差，将1～7#试管在562 nm比色测定3次，求平均值.结果见表2、3.

表2 比色法测定结果

管号1234567蛋白的质量浓度/(μg·μL-1)00．06250．1250．250．512吸光值00．22400．05070．11530．20760．42260．7957

标准曲线见图1.

图1 BCA蛋白定量分析图

3.2 蛋白的完整性分析

TCA/丙酮沉淀法、改良的TCA /丙酮沉淀法和试剂盒法提取的蛋白质经聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，如图2所示.三种方法均提出蛋白，但是TCA/丙酮沉淀法提取的蛋白条带最弱，而改良的TCA/丙酮沉淀法、试剂盒法提取的蛋白条带相对比较清晰，两种方法都没有拖尾现象，蛋白没有降解，质量很高.

表3 三种方法提取肌肉蛋白质量浓度结果

TCA改良试剂盒吸光值0．6370．6421．3921．4181．4081．4171．4061．4100．645平均值0．6411．4061．411蛋白质量浓度/(μg·μL-1)1．5943．5113．524

图2 大鼠肌肉组织聚丙烯酰胺凝胶电泳注: M为标准蛋白marker , (A)为TCA/丙酮沉淀法提出的蛋白，(B)为试剂盒法提出的蛋白，(C)为改良的TCA/丙酮沉淀法提取出的蛋白.

4 讨 论

动物组织蛋白质提取蛋白的样本种类比较多，从蛋白含量、纯度、凝胶电泳检测、实验经费、适合大量提取和实验教学等方面进行综合考虑.本实验采用的改良TCA/丙酮沉淀法蛋白纯度和质量浓度在理想值之间，该方法提取蛋白质不仅效率高，而且杂质少，电泳结果蛋白条带清晰，数量多.此方法的实验条件相对较低，操作简单，不需要很多的仪器设备，相对其他方法比较便宜，广泛性高，更适合于肌肉组织蛋白的大量提取.试剂盒操作法蛋白纯度和质量浓度在理想值之间，然而不适合实验教学和大量提取，且因试剂盒价格比较贵，蛋白提取时使用的供试材料很少(0.02～0.1 g)，更适合于相对比较珍贵的供试材料.本文研究结果表明改良的TCA/丙酮沉淀法更适合大鼠肌肉蛋白的提取效率高、效果更佳.因此，本研究采用改良的三氯乙酸TCA/丙酮沉淀法适合于动物组织肌肉蛋白提取，可为相关的组织蛋白的提取方法提供实验依据.

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Method comparison of rat muscle extraction from tissue protein

MENG Yong-hai1,2, WANG Xin-wei1,2, SHI Lian-hong1,2,KANG Tian-ji1, CHEN Zhong-xin1, LI Ji3, ZHAI Chun-mei1,2

(1. Key laboratory of Chinese Materia Medica, Heilongjiang University of Chinese Medicine, Harbin 150040, China; 2. Ministry of Education, Heilongjiang Key Laboratory of TCM Pharmacodynamic Material Base, Harbin 150040, China)

The extraction methods of tissue protein were established and optimized. The tissue proteins of rats were extracted by TCA/acetone, improved TCA/acetone and tissue protein extraction kit. Then the optical density of extracted proteins was detected and the protein was further determined using sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis. UV spectrum analysis showed that the protein content is lower at 562 nm using TCA/ acetone method but higher using improved the TCA/acetone and tissue protein extraction kit method. Results of sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis confirmed that the protein fragments of TCA/acetone method was the weakest among them. The protein fragments of the others were clear, and there were no degradation or trailing phenomena.

rats; protein extraction; Protein quantitative; sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis

2015-02-27.

黑龙江省青年科学基金项目(QC2012C064)；黑龙江省自然科学基金面上项目(H201473)；黑龙江省教育厅科研课题(12531622)；黑龙江中医药大学优秀青年教师支持计划项目(2012RCQ16)

作者简介：孟永海(1978-)，男，博士，研究方向：中药药效物质基础

翟春梅(1978-)，女，博士，高级实验师，研究方向：中药新药及药效物质基础.

Q51

A

1672-0946(2015)06-0661-03