新生大鼠胰腺干细胞的分离和培养及初步鉴定

张巨彪，苏秀兰，欧阳晓晖※

(1.内蒙古自治区人民医院肿瘤外科，呼和浩特 010010； 2.内蒙古医科大学中心实验室，呼和浩特 010010)



新生大鼠胰腺干细胞的分离和培养及初步鉴定

张巨彪1，苏秀兰2，欧阳晓晖1※

(1.内蒙古自治区人民医院肿瘤外科，呼和浩特 010010； 2.内蒙古医科大学中心实验室，呼和浩特 010010)

摘要：目的探讨分离、培养及初步鉴定新生大鼠胰腺干细胞的方法。方法取30只无特定病原体(SPF)级新生大鼠的胰腺组织，用完整胰腺胶原酶消化法分离胰岛。以低糖改良Eagel培养液为基础培养液，于不同时期分别添加血清、碱性成纤维细胞生长因子、表皮细胞生长因子、胰岛素-转铁蛋白-硒添加剂、白血病抑制因子、神经干细胞原代培养的无血清培养液中的营养因子B27、神经元培养的无血清培养液中的营养因子N2等进行培养，倒置相差显微镜下观察其形态学特征及生长特性。应用免疫细胞化学法对培养不同时期的细胞进行巢蛋白(Nestin)及细胞角质蛋白19(CK-19)检测，并进行初步鉴定。结果①新生大鼠胰腺内纤维组织少，体积小，完整胰腺胶原酶消化法简化了胰岛分离步骤，减少了污染机会，有利于进一步培养。②培养24 h可见细胞贴壁,但贴壁细胞数量较少,改用无血清培养后,贴壁细胞快速生长，10~15 d形成单层细胞汇集,细胞形态较一致。③培养所得细胞一直较多表达胰腺干细胞的标志物Nestin，随培养时间延长，表达CK-19的细胞数量逐渐增多。结论新生大鼠胰腺消化后，获得的细胞于不同时期表达胰腺干细胞的标志物Nestin、CK-19。

关键词：胰腺干细胞；移植；细胞分离；细胞培养；大鼠

干细胞是体内存在的特殊细胞，既有自我更新和不断增生的能力，又有多向分化的潜能，这种特点使其成为获得大量胰岛β细胞的最佳种子细胞,只要掌握了胰腺干细胞的特异标志、转化调控机制、培养及分离技术就可以体外操纵干细胞，大量扩增和定向诱导分化，最后得到胰岛样细胞[1-2]。

尽管胰腺干细胞的研究及移植已有成功的报道，但是胰腺干细胞的分离、培养、鉴定与诱导为靶细胞的研究，乃至用于治疗糖尿病的研究仍然存在一些问题，尚未能用于临床，因此需要进一步深入研究。本实验对新生大鼠胰腺组织中胰腺干细胞的分离、培养和初步鉴定等方面进行研究，目的是建立一套比较有效的技术和方法，进而获得单一性和富集度均较高的胰腺干细胞。

1材料与方法

1.1材料30只新生无特定病原体(specific pathogen free,SPF)大鼠(2~4 d)购自内蒙古大学实验动物中心，体质量220～280 g，饲养室内氨浓度<20 g/L，相对湿度为40%～70%，室温18～25 ℃，普通饲料喂养，饲水自由，实验前1 h领取。

1.2方法

1.2.1含血清培养液的制备取改良型Eagel培养液，加10%胎牛血清,100 U/mL青霉素、100 μg/mL链霉素，加β-巯基乙醇终浓度为 71.5 μmol/L,丙酮酸钠终浓度1 mmol/L，HEPES终浓度为 1 mmol/L，加入多鸟氨酸终浓度为10 μg/mL,牛纤维连接蛋白终浓度为2 μg/mL，刀豆素A终浓度为 1 μg/mL，过滤除菌,4 ℃冰箱保存。

1.2.2无血清培养液的制备取改良型Eagel培养液，加100 U/mL青霉素、100 μg/mL 链霉素，羟乙基哌嗪乙磺酸终浓度为1 mmol/L，碱性成纤维细胞生长因子、表皮细胞生长因子各 20 ng/mL，1400 U/mL白细胞抑制因子，2%神经细胞原代培养的无血清培养液中的营养因子B27、1%神经元培养的无血清培养液中的营养因子N2添加剂，过滤除菌,4 ℃冰箱保存。

6 d后(大约换液3次)，用不含碱性成纤维细胞生长因子的无血清培养液进行培养。

1.2.3新生大鼠胰腺干细胞的体外分离和培养无菌条件下完全游离胰腺后取出，放入4 ℃ D-Hank′s(无钙镁离子的Hank′s液)液中，再放入50 mL的消化瓶中，加入胶原酶6 mL，封瓶后放入37 ℃恒温水浴中消化12 min，立即加入4 ℃ D-Hank′s液40 mL中，用吸管反复吹打至胰腺团块消失，自然沉降，弃去上清液，反复吹打3次，收集沉降的消化物。取D-Hank′s液稀释后的胰岛制备物3 mL,加入配制好的双硫腙液5 μL,混匀后静置3 min,倒置相差显微镜下观察。培养瓶中加入5 mL含血清培养液。为初步鉴定细胞，培养板的3个孔中预先放入无菌处理后的盖玻片，每孔加入1 mL含血清培养液。培养瓶与培养板均过夜后使用。将分离好的胰岛制备物加入配制好的8 mL含血清培养液，充分吹打均匀，于培养板的3个孔中每孔加入1 mL，使每孔中共含培养液2 mL，将剩余的制备物平均放入两个25 cm2细胞培养瓶中，置入37 ℃、5%CO2培养箱中培养。

72 h后可见有细胞贴壁生长，但胰岛细胞不贴壁，弃去不贴壁细胞及胰岛，换用无血清培养液培养，每48小时换液1次，3次后，换用不含碱性成纤维细胞生长因子的无血清培养液继续培养，倒置显微镜下观察细胞生长情况，可见贴壁细胞呈较快速度生长,10~15 d可形成单层细胞汇合。

10~15 d后，细胞约长满培养瓶70%进行传代，用 0.05%胰酶消化5 min，吹打均匀后接种在含血清培养液中，重复前述培养。

1.3免疫细胞化学染色细胞培养同前，于培养的第4、8、12日取出细胞培养板中的盖玻片，行免疫细胞化学染色进行初步鉴定。将培养液弃去，磷酸盐缓冲液洗涤3次，以4%多聚甲醛37 ℃固定20 min,磷酸盐缓冲液(phosphate buffered saline，PBS)洗涤3次，加50 μL过氧化物酶阻断液，室温孵育10 min,PBS洗涤3次，加50 μL正常动物非免疫血清，室温孵育5 min,PBS洗涤3次，Nestin加入50 μL 1∶100稀释的Nestin，细胞角质蛋白19(cyto-keratoprotein-19,CK-19)的检测加入50 μL 1∶100稀释的CK-19，室温孵育90 min,PBS洗涤3次，加入即用型、生物素标记的广谱型二抗，室温孵育10 min,PBS洗涤3次，加入50 μL链霉菌抗生物素-过氧化物酶溶液，室温下孵育 10 min,PBS洗涤3次，加入新配制的100 μL过氧化物酶反应底物3,3′-二氨基联苯胺，室温下10 min，镜下观察,PBS洗涤，中止反应,以上PBS洗涤每次5 min，苏木素复染细胞核1 min，流水冲洗，1%盐酸酒精分化3 s，自来水冲洗5 min，浸水，蓝化,空白对照使用 PBS替代一抗，其余条件相同,结果观察:阳性为细胞胞质染成棕黄色；阴性为胞质不着色。细胞计数法:在倒置相差显微镜下放大100倍观察，计数四角大方格中的细胞。

2结果

2.1新生大鼠胰腺干细胞的体外分离和培养结果

2.1.1新生大鼠胰腺干细胞的体外分离结果新生大鼠完整胰腺经胶原酶消化后，可见胰腺组织散落呈细颗粒状，终止消化后，反复吹打，组织完全散开，肉眼见大块组织消失，呈均匀一致的细颗粒样悬液，经3次沉降后即可获得胰岛制备物。倒置相差显微镜下可见大量细胞团及散在的细胞，双硫腙染色后可见亮红色的胰岛细胞(图1，见封三)。

2.1.2新生大鼠胰腺干细胞的体外培养结果培养72 h可见细胞贴壁,但贴壁细胞形态不一,数量较少,改用无血清培养48 h后,贴壁细胞数量增加，混有少量成纤维细胞，约达培养板面积的5%(图2，见封三)。此时弃去不贴壁细胞,贴壁细胞生长速度加快，换用不含碱性成纤维细胞生长因子的无血清培养液后，成纤维细胞数量逐渐减少，可见贴壁细胞呈较快速度生长,10~15 d可形成单层细胞汇合(图3，见封三)。

2.1.3新生大鼠胰腺干细胞传代培养结果本实验中，胰腺干细胞最多可传至第3代，之后，细胞分裂开始停滞，活力逐渐降低，最终碎裂、死亡。

2.2新生大鼠胰腺干细胞的免疫细胞化学染色结果培养的第4、8、12日取出细胞培养板中的盖玻片，行免疫细胞化学染色检测Nestin与CK-19，其中CK-19与Nestin的抗体浓度均为1∶100。在培养第4日可见一些多角形上皮样细胞，单核，呈附壁生长，Nestin表达阳性，胞质染成棕黄色(图4，见封三)，成纤维细胞样生长的细胞散在分布，形态不规则，多为长梭形，Nestin与CK-19染色均呈阴性反应。第8日后可见培养细胞中仍多数表达Nestin(图5，见封三)，表达CK-19的阳性细胞比例开始增加(图6，见封三)，胞质染成棕黄色，空白对照阴性。第12日时，大多数培养细胞表达CK-19(图7，见封三)与Nestin，成纤维细胞样逐渐减少，空白对照仍为阴性。

3讨论

研究显示，胰腺导管上皮细胞体外培养可获得胰岛细胞，并能使糖尿病动物模型血糖恢复正常；胰腺内也存在Nestin阳性细胞，体外分离和培养后可形成胰岛样结构[3-4]。新生大鼠胰腺内纤维组织少，采用完整胰腺消化，组织消化完全，对胰岛损伤较小，可获得完好的胰岛，满足进一步实验的要求，省略了胰腺组织剪碎的过程，减少了组织污染机会，有利于组织培养[5]。

血清中含有丰富的营养成分，对细胞有去分化作用,影响细胞功能，血清还可促进成纤维细胞生长,造成优势效应而抑制上皮细胞的生长。本研究先用含血清培养液,使胰腺细胞尽快贴壁,贴壁后改为含多种生长因子的无血清培养液，换液3次后，改用不含碱性成纤维细胞生长因子的无血清培养液，达到控制成纤维细胞繁殖、促进胰腺干细胞生长的目的。

研究认为，胰腺干细胞体外扩增、培养时均呈贴壁生长，形态为多角形上皮样[6]。本实验结果与之类似，新生大鼠胰腺干细胞体外培养时，呈克隆性生长，贴璧时，呈多角形上皮样，核为圆形，单、双或多核仁。胰腺干细胞特异性标志物还没有最终完全确定，目前较为公认的特异性标志物有以下几种[7-8]：Nestin、CK-19、胰肠同源域因子1、神经原因子3、波形蛋白等。

本研究为确定新生大鼠胰腺干细胞的表达特征，参照多种研究结果，在免疫细胞染色实验中选用Nestin和CK-19标志物的抗体对胰腺干细胞抗原进行了检测。结果显示，随着培养时间延长，共表达Nestin与CK-19的细胞数量逐渐增多。

参考文献

[1]Wang W,Walker JR,Wang X,etal.Identification of small-molecule inducers of pancreatic beta-cell expansion[J].Proc Nati Acad Sci U S A,2009，106(5):1427-1432.

[2]Suen PM,Leung PS.Pancreatic stem cells:a glimmer of hope for diabetes?[J].JOP,2005,6(5):422-424.

[3]Yatoh S,Dodge R,Akashi T,etal.Differentiation of affinity-purified human pancreatic duct cells to β-cells[J].Diabetes,2007,56(7):1802-1809.

[4]史恺，徐立，邓仪昊.昆明小鼠胰腺导管上皮样细胞的培养方法研究[J].四川解剖学杂志，2006,14(4):72-73.

[5]白日星，田井琦，张海燕.新生鼠胰岛干细胞分离、培养和分化的实验研究[J].中国普通外科杂志，2004,13(10):746-749.

[6]Kajiyama H,Hamazaki TS,Tokuhara M,etal.Pdx1-transfected adipose tissue-derived stem cells differentiate into insulin-producing cells in vivo and reduce hyperglycemia in diabetic mice[J].Int J Dev Biol,2010,54(4):699-705.

[7]Claiborne KC,Stoffers DA.Toward a cell-based cure for diabetes:advances in production and transplant of beta cells[J].Mt Sinai J Med,2008,75(4):362-371.

[8]Gioviale MC,Bellavia M,Damiano G,etal.Beyond islet transplantation in diabetes cell therapy:form embrymic stem cells to transdifferentiation of adult cells[J].Transplant Proc,2013,45(5):2019-2024.

张巨彪，苏秀兰，欧阳晓晖

新生大鼠胰腺干细胞的分离和培养及初步鉴定

图1新生大鼠胰岛细胞分离后在倒置显微镜下被染成红色(双流腙×100)

图2新生大鼠胰岛细胞分离后培养72 h后在倒置相差显微镜下形成的贴壁细胞(双流腙染色×100)

图3新生大鼠胰岛细胞分离后培养10 d后在倒置相差显微镜下形成的贴壁细胞(双流腙染色×40)

图4培养4 d后的贴壁细胞在倒置相差显微镜下Nestin呈阳性(免疫细胞化学染色×100)

图5培养8 d后的贴壁细胞在倒置相差显微镜下Nestin呈阳性(免疫细胞化学染色×100)

图6培养8 d后的贴壁细胞在倒置相差显微镜下CK-19呈阳性(免疫细胞化学染色×100)

图7培养12 d后的贴壁细胞在倒置相差显微镜下CK-19呈阳性(免疫细胞化学染色×40)

Isolation，Cultivation and Identification of Pancreatic Stem Cells from Newborn RatsZHANGJu-biao1,SUXiu-lan2,OUYANGXiao-hui1. (1.DepartmentofSurgicalOncology,InnerMongoliaPeople′sHospital,Hohhot010010,China; 2.CentralLoaboratory,InnerMongoliaMedicalUniversity,Hohhot010010,China)

Abstract：ObjectiveTo explore the method of isolation,cultivation and identification of pancreatic stem cells in newborn rats.MethodsA total of 30 newborn rats were bought from Experimental Animal Center,Inner Mongolia University.Get the rats 1 h before experiments.The whole pancreas of newborn rats were digested with collagenase,and cultivated with the basic Eagel culture solution modified with low.Serum,bFGF,EGF,ITS,LIF,N2,B27 were added to culture solution during different phases,the digested tissue fragments were cultured.The whole formation process of new pancreatic stem cells was observed under the inverted phase contrast microscope.The expression of Nestin and CK-19 was tested using immunocytochemical method.Results①Because there was little fibrous tissue in newborn rat,its pancreas and the volume of pancreas were tiny,the opportunity of contamination was greatly reduced，so as to make further experiments.②After 24 hours,some cells adhered to the surface of the culture plates,but the number of them was small,then we removed the liquid, and added medium of free serum,the number of them increased obviously,10-15 days later,a newly formed monolayer of cells could be observed, their shapes were uniform.③During the cultivation period,the cells came from the pancreas of newborn rats expressed large amount of Nestin,and as the cultivation time prolonged,the expression of CK-19 increased.ConclusionAfter digestion of newborn rat′s pancreas, the cells express Nestin and CK-19, which are the markers of the expression of pancreatic stem cells,during different periods.

Key words：Pancreatic stem cells; Transplant; Cells isolation; Cells cultivation; Rat

收稿日期：2013-07-29修回日期：2014-10-31编辑：伊姗

doi：10.3969/j.issn.1006-2084.2015.02.047

中图分类号：R617

文献标识码：A

文章编号：1006-2084(2015)02-0315-02