HPLC-MS/MS测定鱼罐头中乙二胺四乙酸二钠残留量

张晓华，曾繁华，张锐夫

（1.牡丹江市质量技术监督检验检测中心，黑龙江牡丹江157021；2.大连出入境检验检疫局，辽宁大连116611；3.牡丹江出入境检验检疫局，黑龙江牡丹江157005）

乙二胺四乙酸二钠（EDTA）是GB2760 允许使用的一种食品添加剂[1]，可与铁、铜、钙、镁等多价离子螯合成稳定的水溶性络合物，利用其络合作用来防止由金属引起的变色、变质、变浊及维生素C 的氧化损失，起到护色、抗氧化作用[2]。由于其良好的添加效果，常被作为抗氧化剂、防腐剂、稳定剂和凝固剂而广泛的应用于加工食品中[3]，但过多的乙二胺四乙酸二钠被人食入后，会对人身造成伤害，其每日允许摄入量（ADI）值为0～205mg·kg-1。国外对EDTA 在食品中的残留量有严格的限量规定。日本规定罐头食品中EDTA 的残留（以乙二胺四乙酸二钠钙计）不得超过250mg·kg-1,饮料中不得超过35mg·kg-1[4]。我国在八宝粥等罐头食品中规定不得超过250mg·kg-1[1]。

目前，有关于食品中乙二胺四乙酸二钠残留量国内报道很多[5-8]，但针对鱼罐头食品中乙二胺四乙酸二钠残留量检测无文献报道，大多采用液相色谱法进行检测，样品经水提取，经CuCl2或三氯化铁衍生后，采用离子对试剂和C18柱进行液相色谱分析检测，测定低限达50～100mg·kg-1。国外有关食品中乙二胺四乙酸二钠的含量检测的文献报道不多，Takashi Hamano 等人采用分光光度法测定食品中乙二胺四乙酸二钠的含量[9]，利用三氯化铁衍生后进行分析检测，线性范围在0.5～40.0μg·cm-3；Brilliantes,S 等人采用液相色谱法测定罐装海产品中乙二胺四乙酸二钠的含量[10]，用弱乙酸提取，经CuCl2衍生后，采用C8柱进行液相色谱分析检测，线性范围为25.1～301.7mg·kg-1；Carolina E. Cagnasso 等人采用液相色谱法测定非酒精饮料中乙二胺四乙酸二钠的含量[11]，定量限为2.0mg·L-1；Ralph Fingerhut等人在新生儿筛查中采用液相色谱-质谱/质谱法测定干血浆样品中乙二胺四乙酸二钠的含量[12]，样品经四丁醇酯化后，采用液相色谱-质谱/质谱法进行测定，方法的定量限为84μmol·L-1；Congmin Z.Xie 等人采用反相离子对液相色谱法测定生活废水中乙二胺四乙酸二钠的含量[13]，定量限为0.005mg·L-1；Jos'e Benito Quintana 等人采用反相离子对液相色谱-质谱/质谱法测定水中乙二胺四乙酸二钠的含量[14]，定量限为0.001mg·kg-1。本研究的关键是采用三氯化铁衍生化、三氯甲烷和MAX 阴离子交换柱净化，用超高效液相色谱-质谱/质谱仪检测和确证，外标法定量,取得了满意的结果。该方法具有快速、灵敏、准确等特点，能满足国内外检测限量要求。

1 实验部分

1.1 材料与试剂

甲醇、三氯甲烷、三正丁胺（均为色谱纯）美国Fisher 公司；甲酸（88%，A.R.国药集团化学试剂有限公司）；HAc（A.R.天津市光复科技发展有限公司）；HCl（优级纯天津市耀华化学试剂有限责任公司）；FeCl3（A.R.天津市科密欧化学试剂有限公司）；乙二胺四乙酸二钠标准品（CAS:6381-92-6，纯度大于等于99%购自Sigma-Aldrich 公司）；实验用水均为去离子水；MAX 阴离子交换柱（150mg，6mL 美国Waters 公司）；水相滤膜（0.22μm奥特赛恩斯公司）；

0.02mol·L-1FeCl3溶液：称取0.5406g FeCl3，溶于90mL 水中，转移到100mL 容量瓶中，加入HCl 0.03mL，用水定容至刻度，混匀；

10%甲醇水溶液（含5mmol 三正丁胺,pH 值为3.5）：移取100mL 甲醇，溶于880mL 水中，加入1.17 mL 三正丁胺，用HAc 调节pH 值至3.5，转移到1000mL 容量瓶中，用水定容至刻度，混匀；

95%甲醇水溶液（含5mmol 三正丁胺,pH 值为3.5）：移取950mL 甲醇,溶于30mL 水中，加入1.17mL三正丁胺，用HAc 调节pH 值3.5，转移到1000mL容量瓶中，用水定容至刻度，混匀；

10%甲酸甲醇水溶液：移取10mL 甲酸，溶于40mL 水中，转移到100mL 容量瓶中，用甲醇定容至刻度，混匀。

标准储备溶液：分别准确称取适量的乙二胺四乙酸二钠标准品，用水溶解并定容至100mL 棕色容量瓶中，分别得浓度为10mg·mL-1的标准储备溶液，此溶液转移至储液瓶中4℃下储存一个月。

标准中间溶液：准确吸取乙二胺四乙酸二钠储备溶液10mL 于50mL 棕色容量瓶中，用水稀释成浓度为2mg·mL-1的标准中间溶液，此溶液转移至储液瓶中4℃下储存一个月。

标准工作溶液：根据需要使用前用空白样品基质配制适当混合标准工作溶液。

MAX 阴离子交换柱：使用前依次用5mL 甲醇、5mL 水活化。

1.2 仪器与设备

Waters Quattro Premier 超高效液相色谱-质谱/质谱联用仪（配ESI-电离源）（美国Waters 公司）；电子天平（感量0.01mg，0.01g 梅特勒-托利多国际贸易（上海）有限公司）；组织捣碎机（上海精科实业有限公司）；离心机（5 000r·min-1湘仪离心机仪器有限公司）；旋涡混合器（德国IKA 公司）；均质器（德国IKA 公司）；超声波清洗机（昆山市超声仪器有限公司）；氮吹仪（美国Organomation 公司）；50mL 螺旋盖聚丙烯离心管；25、50mL 玻璃具塞离心管。

1.3 分析条件

1.3.1 色谱条件 色谱柱：Phenyl 柱，50mm×2.1mm（内径），粒度1.7μm，或相当者；流动相:见梯度洗脱程序表1；流速：0.25mL·min-1；柱温：25℃；进样量：5μL。

表1 梯度洗脱程序表Tab.1 Gradient program of mobile phase

1.3.2 质谱条件 离子源：ESI,负模式；扫描方式：多反应监测（MRM）；源温度：110℃；去溶剂气流量：550L·hr-1；N2气；去溶剂温度：350℃；锥孔气流量：50L·hr-1,N2；碰撞气压力：3.30×10-4KPa,Ar，纯度≥99.999%；毛细管电压：3.0kV；其它质谱参数见表2。

表2 乙二胺四乙酸二钠衍生物的定性离子对、定量离子对、锥孔电压和碰撞气能量Tab.2 MRM transitions of precursor/product ion for qualitative and quantitative analysis,cone voltage，collision energy of EDTA disodium derivative

1.4 样品前处理

1.4.1 提取 称取鱼罐头试样约5g（精确到0.01g）于50mL 螺旋盖聚丙烯离心管中，加入15mL 水，再加入20mL 三氯甲烷，用均质器以10000r·min-1均质2min，4500r·min-1离心5min。将上清液转移至50mL 玻璃具塞离心管中。再用15mL 水重复提取两次,合并提取液于同一50mL 玻璃具塞离心管中，待衍生化和净化。

1.4.2 衍生化[2]

1.4.2.1 样品溶液的衍生化 向上述提取溶液中加入1.0mL 0.02mol·L-1FeCl3溶液，混合，于超声波中超声20mim，冷却至室温后，转移至50mL 容量瓶中，用水定容至刻度。

1.4.2.2 标准溶液的衍生化 准确吸取适当浓度的标准工作液于50mL 玻璃具塞离心管中，加入40mL水和1.0mL 0.02mol·L-1FeCl3铁溶液，以下操作同1.3.2.1。

1.4.3 净化 准确移取5mL 上述衍生化样品溶液转移到MAX 阴离子交换柱中，控制流速在1～2 mL·min-1，弃去流出液。用5mL 水、5mL 甲醇和3mL 10%甲酸甲醇水溶液淋洗，弃去流出液。最后用6mL 10%甲酸甲醇水溶液洗脱，收集洗脱液。洗脱液经80℃氮吹仪吹干后，用5mL水溶解并定容，过0.22μm滤膜，供超高效液相色谱-质谱/质谱仪测定。

2 结果与讨论

2.1 测定方法的选择

乙二胺四乙酸常用H4Y 表示，由于其在水及酸中的溶解度很小，常用的为其二钠盐：Na2H2Y2H2O，也简写为EDTA。当溶液的酸度很高时，两个羧基可再接受H+，形成H6Y2+，相当于一个六元酸，有六级离解常数：Ka1=10-0.9、Ka2=10-1.6、Ka3=10-2.1、Ka4=10-2.8、Ka5=10-6.2、Ka6=10-10.3；7 种形式：H6Y2+、H5Y+、H4Y、H3Y-、H2Y2-、HY3-、Y4-；当pH ＜1 时，主要以H6Y2+形式存在；当pH 值＞11 时，主要以Y4-形式存在配位离子[15]。从中可以看出，EDTA 是极性很强化合物，如果不进行金属离子络合和采用离子对试剂，很难采用液相色谱法（紫外检测器）测定其含量，国内外的文献报道大都基于此；Jos'e Benito Quintana 等人采用反相离子对液相色谱-质谱/质谱法测定水中乙二胺四乙酸二钠的含量[14]，使乙二胺四乙酸二钠不进行酯化进行LC-MS/MS 测定成为可能。所以本标准最后选用UPLC-MS/MS 进行研究，经实验本方法的测定低限为20mg·kg-1，完全能满足食品中乙二胺四乙酸二钠最低限量为25mg·kg-1的要求。

2.2 衍生化试剂的确定

由于EDTA 是极性很强化合物，极容易与金属离子络合，形成稳定的鳌合物。EDTA 为六齿螯合剂，可以一个分子和二价及三价金属以1∶1 比例形成螯合物。在溶液中存在多种金属离子时，EDTA螯合优先与稳定常数大的金属离子进行反应。螯合物稳定常数表示EDTA 金属螯合物的稳定状态，LogK（稳定常数）越大，表示该螯合物越稳定，越有利优先发生螯合反应。EDTA 螯合金属离子稳定性排序为Mo6+＞Bi3+＞Fe3+＞Cu2+＞Zn2+＞Fe2+＞Mn2+＞K+＞Ca2+＞Mg2+。虽然Mo6+和Bi3+稳定常数大，但在食品中含量是极微量的，所以用Fe3+与乙二胺四乙酸二钠鳌合进行含量测定要比有些文献方法采用CuCl2作为衍生化试剂要稳定得多，其螯合物见图1。

图1 乙二胺四乙酸二钠鳌合物Fig.1 Chelate of EDTA disodium

所以本方法中选择FeCL3作为衍生化试剂进行方法检测是可靠、可行的。

2.3 净化方法的选择和优化

鱼罐头等样品基质，虽然进行了三氯甲烷初步的净化，但仍然达不理想的净化效果，色谱峰分叉比较明显，无法进行液相色谱-质谱/质谱分析测定，详见图2。

图2 未经MAX 柱阴离子交换柱净化的乙二胺四乙酸二钠色谱图Fig.2 MRM chromatogram of EDTA disodium without the MAX anion exchange column purification

为此，我们选择了固相萃取柱的净化试验。分别选择HLB、C18、WAX、NH2、MAX 柱进行了固相萃取柱的净化试验，结果表明：HLB、C18、WAX、NH2柱的保留效果不好，起不到净化的目的；MAX 柱保留效果和净化效果都比较理想，但洗脱起来非常困难。如果酸度达不到一定程度，很难将乙二胺四乙酸二钠的衍生物从MAX 柱洗脱下来。为此，我们进行了洗脱溶剂的选择。首先，选取0.2mol·L-1三氯乙酸和甲醇，配制成5%三氯乙酸-甲醇溶液、10%三氯乙酸-甲醇溶液、20%三氯乙酸-甲醇溶液、30%三氯乙酸-甲醇溶液进行了MAX 柱的洗脱实验，结果表明：20%三氯乙酸-甲醇溶液只用10mL 就能完全将乙二胺四乙酸二钠的衍生物洗脱下来。但如果不吹干直接上液质那是不行的，因为三氯乙酸的酸度太大，质谱的峰型很差，无法进行定量分析。如果进行吹干处理，处理后样品中仍然有酸性存在，所以就放弃了这种洗脱方式。其次，选取甲酸、水和甲醇，主要考虑甲酸是挥发性有机酸，容易吹干，配制成2%甲酸甲醇水溶液（2+50+48，V/V）、5%甲酸-水-甲醇水溶液（5+50+45，V/V）、10%甲酸-水-甲醇水溶液（10+50+40，V/V）、15%甲酸-水-甲醇水溶液（15+50+35，V/V）进行了MAX 柱的洗脱实验，结果表明：2%甲酸甲醇水溶液和5%甲酸-水-甲醇水溶液所用的洗脱体积大约在15mL 以上，15%甲酸-水-甲醇水溶液洗脱又太快，仅需要1mL，而10%甲酸-水-甲醇水溶液所用洗脱体积在6mL 以内，吹干后进行质谱检测，峰型很好，所以本净化方法选择了10%甲酸-水-甲醇水溶液作为洗脱溶剂，具体的洗脱曲线见图3。

图3 MAX 柱阴离子交换固相萃取柱洗脱曲线Fig.3 MAX eluate curve of the anion exchange solid-phase extraction column

2.4 色谱柱和流动相的选择

据文献报道[4，6，7]，利用液相色谱分析EDTA 螯合物常用的色谱柱为C18色谱柱，流动相通常采用四丁基氢氧化铵水溶液等离子对试剂进行分析。如果对EDTA 螯合物采用LC-MS/MS 进行分析测定，其色谱柱要有一定保留，且离子对试剂要具有很强的挥发性，通常的离子对试剂是不能使用。为此，本试验选择了C18（50mm×2.1mm（i.d）,1.7μm）、Phenyl（50mm×2.1 mm（i.d）,1.7μm）液相色谱柱和含有一定量三正丁胺的甲醇水溶液作为流动相进行了实验。结果表明：C18液相色谱柱的色谱峰不尖，而且分叉；而Phenyl 液相色谱柱没有出现这种情况，而且分离度和灵敏度都能满足要求，所以本文的定量分析选择了Pheny 液相色谱柱作为本实验方法的色谱柱。对于流动相的选择，我们选择了4 种不同溶剂配比：10%甲醇水溶液（含5mmol 三正丁胺,pH 3.5）-100%甲醇、10%甲醇水溶液（含5mmol 三正丁胺,pH3.5）-80%甲醇水溶液、10%甲醇水溶液（含5mmol 三正丁胺,pH 3.5）-90%甲醇水溶液（含5mmol 三正丁胺,pH 3.5）、10%甲醇水溶液（含5mmol 三正丁胺,pH 3.5）-95%甲醇水溶液（含5mmol 三正丁胺,pH 3.5）。

试验表明：10%甲醇水溶液（含5mmol 三正丁胺,pH3.5）-90%甲醇水溶液（含5mmol 三正丁胺,pH3.5）和10%甲醇水溶液（含5mmol 三正丁胺,pH3.5）-95%甲醇水溶液（含5 mmol 三正丁胺,pH3.5）这两种流动相，EDTA 螯合物的出峰时间和峰形都比较理想，但10%甲醇水溶液（含5mmol 三正丁胺,pH3.5）-95%甲醇水溶液（含5mmol 三正丁胺,pH3.5）的灵敏度要优于10%甲醇水溶液（含5mmol三正丁胺,pH3.5）-90%甲醇水溶液（含5mmol 三正丁胺,pH3.5）。所以本实验方法的流动相选择为10%甲醇水溶液（含5mmol 三正丁胺,pH3.5）-95%甲醇水溶液（含5mmol 三正丁胺,pH3.5）。

2.5 线性范围的确定

在方法所确定的实验条件下，取一系列不同浓度的乙二胺四乙酸二钠的衍生物标准溶液，以仪器响应峰面积对乙二胺四乙酸二钠的衍生物的浓度进行线性回归，结果表明:当乙二胺四乙酸二钠的衍生物的浓度在1.0～50.0μg·mL-1范围内时，线性关系良好，其相关系数（R2）为0.9922,回归方程为Y=1368.57x+470.384。当样品中的乙二胺四乙酸二钠的衍生物浓度超过上述两个线性范围时，可适当加大样品的稀释倍数。

2.6 方法的测定低限、回收率和精密度

2.6.1 测定低限 测定低限是根据有关国家在鱼罐头等食品中对乙二胺四乙酸二钠限量要求，而采用添加法进行实测的情况确定的。乙二胺四乙酸二钠的测定低限为20mg·kg-1，其基质的标准品谱图、测定低限谱图和基质的空白谱图参见图4～6。可满足国外限量和《基本规定》要求。

图4 乙二胺四乙酸二钠标准品多反应监测色谱图（20mg·kg-1）Fig.4 MRM chromatogram of EDTA disodium derivative standard（20mg·kg-1）

图5 鱼罐头样品添加（20mg·kg-1）色谱图Fig.5 Chromatogram of spiked（20mg·kg-1）in canned fish

图6 鱼罐头样品空白色谱图Fig.6 Chromatogram of blank in canned fish

2.6.2 方法的回收率和精密度实验 本方法以八宝粥罐头为研究对象，采用添加法进行了三个水平的回收率试验，其回收率、精密度的结果见表3。

表3 鱼罐头中乙二胺四乙酸二钠的回收率、精密度（n=6）Tab.3 Recoveries and relative standard deviations of EDTA disodium in canned eight ingredient porridge（n=6）

由表3 可以看出，乙二胺四乙酸二钠在20～400mg·kg-1浓度范围之间，方法的回收率在80.75～105.40%之间，精密度均小于10%，符合残留分析的要求。

3 结论

本文采用固相萃取技术（SPE）和液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）技术相结合的分析方法，解决了鱼罐头等样品基质干扰严重的难题，为食品中乙二胺四乙酸二钠检测和确证，探索了一套新颖的样品前处理方法和色谱分析方法。该方法应用于实际样品检测,效果理想。

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