帕唑帕尼衍生物的合成与初步的活性评价

吴智鸿，赵砚瑾，王永珍，姚郑林，江发龙，匡先照，张养军，李庶心

（1.广西医科大学药学院，广西南宁530021；2.军事医学科学院放射与辐射医学研究所，北京100850）

帕唑帕尼（pazopanib，Votrient）是英国葛兰素史克（GSK）公司研发的一种口服VEGF-2 抑制剂，通过抑制VEGFR 自身的磷酸化，使VEGFR 酪氨酸激酶失活，阻断VEGF 信号[1,2]在肿瘤细胞中的表达，从而抑制血管生成，达到“饿死”肿瘤的目的。已于2009年10月获美国FDA 批准上市，用于治疗晚期肾细胞癌[3,4]。临床试验显示其对肾细胞癌、肉瘤等多种肿瘤有抑制作用，口服生物利用度和药代动力学性质较好，不良反应和毒副作用相对较少[5-7]。作为抗肿瘤药物，帕唑帕尼有许多优点：（1）不易耐药，血管内皮细胞基因[8]相对稳定；（2）抗瘤谱广，所有肿瘤都要依赖于血管供给营养[9]；（3）副作用少，针对肿瘤血管内皮细胞[10]，正常组织血管不易受损；（4）易到达作用部位，药物直接作用于新生血管壁。但其同时仍然存在多种不良反应，最常见的包括腹泻、恶心、呕吐、疲劳、高血压、头发颜色改变和食欲减退。而蛋白尿、AST 升高、锥体外系失调、静脉血栓、肿瘤出血等也很常见[11，12]，限制了临床应用。

本研究的目的是结合帕唑帕尼的构效关系，在保持原有活性必须基团的基础上，对非活性必须基团进行化学修饰，以储备新结构化合物并用于筛选低毒、高效且理化性质更稳定的抗肿瘤化合物。帕唑帕尼类化合物的构效关系[13]为：（1）嘧啶环上的N1、C2可与VEGFR-2 催化位点的Cys919 的多肽骨架酰胺形成氢键相互作用，为活性必须。嘧啶环与吲唑环间的氮原子甲基化对活性影响不大，只会改变口服生物利用度和药代动力学性质；（2）吲唑环除了改进该类化合物的药代动力学性质（包括体内清除率和生物利用度）外，芳香化的吲唑环的π 电子云与Lys868 的ε 氨基可产生较强的相互作用；3-甲基吲唑环上的N 对细胞色素P450 酶（CYP450）的血红素铁有很强的结合作用，导致对大量CYP450 同功酶有抑制性等副作用。为了降低该副作用，可在N 上引入一些取代基增加位阻；（3）苯磺酰胺基团同样是其活性必不可少的片段。

依据帕唑帕尼的构效关系，本研究尝试做出了如下修饰：在嘧啶环C5进行氯取代；去掉嘧啶环与吲唑环间的氮原子上的甲基；对换苯磺酰胺与吲唑环的位置；丰富吲唑环的结构。并以3-硝基-6-甲基苯胺和3-硝基-6-乙基苯胺为原料，通过成环、氨基甲基化、硝基还原、亲核取代反应合成得到了3个目标化合物（如图1），并通过了1H NMR 和LC-MS 的确证，且均未见文献报道。合成路线步骤少，产率高易纯化，可为同类型化合物的合成提供参考。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

JNM-ECA-400 超导核磁仪（400MHz日本电子株式会社）；API-150ex（ESI）型质谱仪（美国AB 公司）。

3-硝基-6-甲基苯胺、3-硝基-6-乙基苯胺和2,4,5-三氯嘧啶，北京偶合有限公司，其余试剂均为国产化学纯或分析纯。

1.2 目标化合物的合成路线

目标化合物1～5 的合成路线见图2。

图2 目标化合物的合成路线Fig.2 Synthetic route of the target compounds

1.3 中间体的合成

1.3.1 6-硝基-2H-吲唑（I1） 将1g 3-硝基-6-甲基苯胺（6.6mmol），加入到20mL HAc 中，再分批加入0.57g NaNO2（8.3mmol），常温搅拌0.5h 后，TLC显示反应完全，减压蒸干溶剂，用乙酸乙酯（30mL）溶解，再用饱和NaHCO3（20mL×3）洗涤，有机层用无水MgSO4干燥，抽滤，减压浓缩，烘干后得橘黄色固体0.5g,产率为47.3%。

1.3.2 3-甲基-6-硝基-2H-吲唑（I2） 实验方法同1.3.1 项下，主要原料投料量分别为1g 3-硝基-6-乙基苯胺（6.0mmol）,NaNO2（0.52g,7.57mmol）,得棕黄色固体0.47g,产率为44.3%。

1.3.3 1-甲基-6-硝基-1H-吲唑（I3） 在100mL三颈瓶中，加入20mL 重蒸DMF，再分批加入0.59g NaH（24.6mmol），冰浴条件下搅拌10min，将2g 6-硝基-2H-吲唑（12.3mmol）分批加入反应瓶中，15min 后恢复室温反应，常温搅拌0.5h 后，滴加CH3I 2.9g（20.4mmol），滴毕搅拌10min，TLC 显示反应完全，将反应液倒入200mL 水中，有固体析出，过滤，滤液用乙酸乙酯萃取（20mL×2），有机层用无水MgSO4干燥，抽滤，减压浓缩，与滤饼一起烘干，通过干法过层析柱得固体0.95g。产率为43.8%。

1.3.4 2-甲基-6-硝基-2H-吲唑（I4） 实验方法同1.3.3 项下，主要原料投料量分别为NaH（0.59g,24.6mmol）,6-硝基-2H-吲唑（2g,12.3mmol），CH3I 2.9g（20.4mmol），得1.15g 固体，产率为52.8%。

1.3.5 1，3-二甲基-6-硝基-1H-吲唑（I5） 实验方法同1.3.3 项下，主要原料投料量分别为NaH（0.27g,11.3mmol）,3-甲基-6-硝基-2H-吲唑（1g,5.6 mmol）,CH3I（2.4g,16.9mmol）,得固体0.68g，产率为63.5%。

1.3.6 1-甲基-6-胺基-1H-吲唑（I6） 在100mL三颈瓶中，加入1-甲基-6-硝基-1H-吲唑1g（5.6 mmol），Fe 粉2.5g（44.6mmol），NH4Cl 1.2g（22.4mmol），乙醇/ 水（4∶1）20mL，搅拌条件下慢慢升温至80℃，0.5h 后，TLC 显示反应完全，趁热过滤，滤液减压浓缩，乙酸乙酯（30mL）溶解，再用清水（20mL×3）洗涤，有机层用无水硫酸镁干燥，抽滤，减压浓缩，烘干后得土黄色固体0.75g，产率为90.3%。

1.3.7 2-甲基-6-胺基-2H-吲唑（I7） 实验方法同1.3.6 项下，主要原料投料量分别为2-甲基-6-硝基-2H-吲唑（3g,16.9mmol），Fe 粉（7.6g,135.7 mmol），NH4Cl（2.7g,50.4mmol），得土黄色固体1.5g，产率为60%。

1.3.8 1，3-二甲基-6-胺基-1H-吲唑（I8） 实验方法同1.3.6 项下，主要原料投料量分别为1，3-二甲基-6-硝基-1H-吲唑（4g,20.9mmol），Fe 粉（9.4g,167.9mmol），NH4Cl（3.4g,63.5mmol），得固体2.6g，产率为76.7%。

1.3.9 （2,5-二氯-嘧啶-4-基）-（1-甲基-1H-吲哚-6-基）-胺（I9） 将1g1-甲基-6-胺基-1H-吲唑（6.8mmol），0.3g NaHCO3（3.6mmol）溶于20mL 乙醇及5mLTHF 中，加入2,4,5-三氯嘧啶3.7g（20.2mmol）,升温至75℃，反应4h 后，有固体析出，TLC 显示反应完全，过滤滤饼用乙醇（10mL×2）洗涤，烘干得黄白色固体0.67g，产率为33.5%。

1.3.10 （2,5-二氯-嘧啶-4-基）-（2-甲基-2H-吲哚-6-基）-胺（I10） 实验方法同1.3.9 项下，主要原料投料量分别为2-甲基-6-胺基-2H-吲唑（1.5g,10.2mmol），NaHCO3（0.43g，5.1mmol）,2,4,5-三氯嘧啶（5.6g,30.6mmol）,得灰白色固体1g，产率为34.0%。

1.3.11 （2,5-二氯-嘧啶-4-基）-（1，3-二甲基-1H-吲哚-6-基）-胺（I11） 实验方法同1.3.9 项下，主要原料投料量分别为1，3-二甲基-6-胺基-1H-吲唑（1g,6.2mmol），NaHCO3（0.26g，3.1mmol）,2,4,5-三氯嘧啶（3.4g,18.6mmol）,得灰白色固体0.62g，产率为32.5%。

1.4 目标化合物的合成

1.4.1 目标化合物1 将0.4g（2,5-二氯-嘧啶-4-基）-（1-甲基-1H-吲哚-6-基）-胺（0.9mmol）与0.25g5-氨基-2-甲基-苯磺酰胺（1.3mmol）溶于20mL 异丙醇中，加入1mL 浓HCl，升温至回流14h 后，TLC 显示反应完全，过滤，滤饼用乙醇（5mL×3）洗涤，烘干得白色固体0.32g，产率为60.0%。

1.4.2 目标化合物2 实验方法同1.4.1 项下，主要原料投料量分别为（2,5-二氯-嘧啶-4-基）-（2-甲基-2H-吲哚-6-基）-胺（0.4g,1.36mmol），5-氨基-2-甲基-苯磺酰胺（0.25g，1.3mmol），得白色固体0.29g，产率为50.3%。

1.4.3 目标化合物3 将（2,5-二氯-嘧啶-4-基）-（1，3-二甲基-1H-吲哚-6-基）-胺（0.4g,1.3mmol）与5-氨基-2-甲基-苯磺酰胺（0.25g，1.3mmol）溶于20mL 仲丁醇中，加入1mL CF3COOH，升温至回流40h 后，TLC 显示反应完全，过滤，滤饼用乙醇（5mL×3）洗涤，烘干得白色固体0.25g，产率为42.0%。

1.5 化合物的体外活性初步评价实验

1.5.1 实验原理 MTT 分析法是以活细胞代谢物还原剂噻唑蓝（MTT）为基础的分析方法。噻唑蓝可作用于活细胞的线粒体中的呼吸链，在琥珀酸脱氢酶和细胞色素C 的作用下四唑环开裂，生成蓝色的甲瓒结晶，甲瓒结晶的生成量仅与活细胞的数目成正比（死细胞中琥珀酸脱氢酶消失，不能将噻唑蓝还原）。甲瓒结晶可被二甲基亚砜（DMSO）溶解，利用酶标仪测定570nm 处的光密度（OD）值，可以反映出活细胞的数目。

1.5.2 实验方法 取培养4～5d，并处于对数生长期的胃细胞癌MGC803 细胞，制成细胞悬液计数。用完全培养基RPMI1640 稀释细胞悬液至所需的细胞浓度。取96 孔平板，每孔加细胞悬液180μL，接种细胞3000/孔,加细胞过程控制在4h,于37℃、5%CO2温箱孵育24h。受试化合物分别溶解并依次稀释成5 个浓度（10-5，5×10-6，10-6，10-7和10-8mol·L-1），每孔加入20μL，在37℃、5%CO2及100%湿度，孵育4～5d。噻唑蓝用生理盐水配成5mg·mL-1溶液，每孔加20μL，37℃温育4h，使噻唑蓝还原为甲臜。吸出上清液，加入200μL 的二甲基亚砜（DMSO）使甲臜溶解，用平板摇床摇匀。用自动化分光光度平板读数计（Model 312,Biotech Research Laboratories,Inc.,Rockville,Md）在570nm 处检测每个小孔的光密度。

2 结果

2.1 化合物的结构鉴定

目标化合物1: 白色固体，ESI-MS m/z：444.1[M+H]+,分子式为C19H18ClN7O2S。1H NMR（400MHz，DMSO）δ：2.51（s,3H）,3.94（s,3H）,6.93-6.95（d,1H）,7.32-7.39（m,3H）,7.74-7.76（d,1H）,7.79-7.82（dd,1H）,7.93（s,2H）,8.032-8.034（d,1H）,8.30（s,1H）,9.51（s,1H）,10.10（s,1H）.

目标化合物2: 白色固体，ESI-MS m/z：444.1[M+H]+,分子式为C19H18ClN7O2S。1H NMR（400MHz，DMSO）δ：2.51（s,3H）,4.17（s,3H）,7.02-7.04（d,1H）,7.24-7.26（dd,1H）,7.39（s,2H）,7.69-7.71（d,1H）,7.78-7.81（dd,1H）,7.89-7.92（d,2H）,8.29（s,1H）,8.35（s,1H）,9.52（s,1H）,10.16（s,1H）.

目标化合物3: 白色固体，ESI-MS m/z：458.1[M+H]+,分子式为C20H20ClN7O2S。1H NMR（400MHz，DMSO）δ：3.85（s,3H）,4.72-4.77（t,6H）,6.98-7.00（d,1H）,7.29-7.33 （m,3H）,7.66-7.68（d,1H）,7.82-7.88（m,3H）,8.23（s,1H）,9.27（s,1H）,9.82（s,1H）.

2.2 化合物的初步活性评价

初步计算的结果显示，目标化合物1～3 对MGC803 细胞的IC50分别为（0.868±0.096）、（88.805±10.819）、（4.322±1.790）μmol·L-1，阳性对照帕唑帕尼的IC50为（4.436±0.757）μmol·L-1。表明化合物1、3 的活性超过或接近阳性对照物帕唑帕尼，表明它们具有较高的抗肿瘤活性，其中1 的生物活性为帕唑帕尼的5 倍，可选为先导化合物作进一步研究，为找寻新的具有更高活性的先导化合物提供了可能。

3 讨论

有文献[5]报道在制备2,3-二甲基-6-硝基-2H-吲唑的过程中，需要用到的原料是三甲基氧鎓四氟硼酸盐或是硫酸二甲酯，但是前者价格昂贵，后者污染严重。本文参考此法，改进反应条件，成功地以氢化钠和碘甲烷为原料，合成出了1，3-二甲基-6-硝基-1H-吲唑（I5）。虽然产率由70%略微降到了63.5%，但实验更经济环保。

目标化合物的体外活性测试表明：（1）1H-吲唑环相比2H-吲唑环有更高的活性，两个活性较好的化合物均为1H-吲唑结构。（2）在嘧啶环C-5 位引入卤素如：氯，有利于增强本类化合物对靶酶的抑制活性。（3）对比目标化合物1、3，表明在吲唑环上即使有相同的取代基，但其余的取代基不同，也会导致化合物的活性有一定的差别。

本文以葛兰素史克公司研发的多靶点VEGFR络氨酸激酶抑制剂帕唑帕尼为先导化合物，寻找合理的构建单元，设计合成了3 个帕唑帕尼衍生物。其中1、3 具有较高的抗肿瘤活性，为找寻低毒、高效、稳定的抗肿瘤药物提供了可能。

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