胶原明胶化程度快速评价体系构建分析与展望

赵 格,康阳妃,刘津宁,张宇昊,2,*

(1.西南大学食品科学学院,重庆 400715;2.西南大学国家食品科学与工程实验教学中心,重庆 400715)



胶原明胶化程度快速评价体系构建分析与展望

赵 格1,康阳妃1,刘津宁1,张宇昊1,2,*

(1.西南大学食品科学学院,重庆 400715;2.西南大学国家食品科学与工程实验教学中心,重庆 400715)

明胶得率和凝胶强度是传统胶原明胶化程度评价的主要指标,但其值测得必须要完成胶原蛋白明胶化和热力提胶两个过程。热力提胶后明胶得率和凝胶强度与明胶化过程中胶原蛋白微观结构的变化密切相关,因此直接根据明胶化的胶原特征结构来评价其明胶化,可以大幅度节约研究时间和成本。本文根据传统酸碱法、酶法、超高压法诱导胶原明胶化过程中的微观结构的变化规律,结合明胶化胶原特征结构及其评价的主要指标的关系,对基于特征分子结构的胶原明胶化评价方法的构建进行了可行性分析和展望。

明胶,胶原蛋白,明胶化,微观结构,快速评价

明胶是一种重要的生物大分子物质,以其良好的凝胶性、乳化性和持水性等特点而广泛应用于食品、医药等领域[1-3]。明胶的制备工艺分为胶原的明胶化和热力提胶两个部分。目前,在工业生产中可大规模诱导胶原明胶化的方法只有酸碱法,但该工艺存在着生产周期长、效率低、污染严重等问题。此外,酸碱还会造成胶原共价键的随机断裂,破坏胶原亚基的完整性,从而降低明胶品质[1,4-5]。针对酸碱法的弊端,国内外学者[5-10]对酶法、超高压法等改进工艺进行了研究,不仅可以有效的诱导胶原明胶化,而且环保清洁,明胶品质好,但因其成本较高,还尚未实现产业化,因此明胶化方法还需改良。目前,明胶化的评价方法主要根据明胶提取后的得率和凝胶强度来评价,每个因素的选择优化均要完成明胶制备的全过程,而明胶热提取、干燥等过程通常要超过24h,如此操作不仅耗时长,而且原料浪费大。研究表明,明胶化过程中胶原会产生一系列微观结构的变化,其变化程度与明胶得率与凝胶强度紧密联系[1,2,11]。因此,如果结合明胶化胶原典型的微观结构与明胶得率和凝胶强度的关系,并以此为依据构建明胶化胶原评价体系,即可对新型明胶化胶原诱导方法做出快速评价,较传统的方法可大幅度节约时间和成本。本文对常见的胶原明胶化诱导方法进行总结,并结合胶原微观结构的变化与明胶得率和凝胶强度的关系,对基于明胶化胶原特征分子结构建立胶原明胶化程度评价方法的可行性进行了分析,旨在为明胶产业的升级提供理论依据。

1 胶原明胶化诱导方法

1.1 酸碱法诱导明胶化

胶原蛋白是由原胶原分子聚合而成,每个原胶原分子由3条自身成左手螺旋结构的α-肽链通过氢键沿公共轴平行螺旋缠绕成超螺旋,形成“三螺旋体”,胶原蛋白分子间和分子内的共价交联和非共价键都维系着胶原结构的稳定[1,11-12]。酸碱法是传统的诱导胶原明胶化方法,该法主要利用酸或碱与胶原纤维分子上的碱性基团或酸性基团结合,打开其分子间和分子内的共价交联和氢键,松散胶原的三螺旋结构,破坏非螺旋结晶区,从而诱导胶原蛋白明胶化,这种微观结构变化可使胶原在热水提胶过程中易于亚基组分(α,β,γ)的释放,利于胶原向明胶的转变[1-2]。朱欣星等[13]采用红外光谱法(FT-IR)对牛跟腱中提取的I型胶原和酸法明胶结构进行了研究,结果显示,明胶不存在完整的三股螺旋结构,其原因在于胶原在明胶化和热处理过程中,维系胶原三股肽链的共价交联和氢键作用减弱或遭到破坏,肽链结构伸展,蛋白质结构变得无序。

明胶生产过程中,长时间或高浓度的酸碱处理,会导明胶品质下降。闫雪等[14]采用优化酸法提取草鱼明胶研究证明了这一点,响应面分析结果表明,随着盐酸浓度的增加,明胶得率和凝胶强度均先增加后减少。这是由于酸导致胶原分子内共价键(肽键)非正常断裂,胶原亚基完整性遭到破坏,进而影响热力提胶后明胶的品质。此外,碱液水解胶原蛋白时,可能会使胶原酰胺侧基逐渐水解,从而使得酰胺基含量降低,精氨酸残基变成鸟氨酸残基;亚氨基酸(脯氨酸和羟脯氨酸)结构被破坏;富含吡咯烷区域发生水解,使明胶中Pro结构被破坏,含量下降,进而降低明胶凝胶强度[1,15-16]。

1.2 其它改进方法诱导明胶化

酶法是目前用于诱导胶原明胶化主要改进方法之一,在明胶化阶段,普通蛋白酶可催化胶原发生部分降解,其主要是通过攻击胶原末端多肽区域(非螺旋区域),裂解非螺旋区分子间的化学交联键使三螺旋结构松散,同时尽量不破坏或少破坏胶原三螺旋区域的α组分从而实现胶原明胶化[2,17]。张峰、韩应昌等[7-8]研究均表明1398中性蛋白酶和胞外金属内肽酶对胶原分子内键不起作用,但可作用于胶原蛋白分子的非螺旋末端肽,解散胶原大分子聚集体并使其溶解,因此可使胶原蛋白明胶化。张兵等[18]采用色谱柱-激光光散色联用分析法(SEC-MALLS)对酸法、碱法、酶法明胶的分子量分布进行研究,测得酶法明胶分子量分布最窄,从4.3×104g/mol到1.0×106g/mol,多分散系数最低,仅为1.470,由此可见酶法诱导胶原蛋白明胶化可以更好的保持胶原蛋白亚基组分的完整性,因此,酶法明胶分子量分布更为集中。

超高压是近年来一种较为环保、有效的胶原明胶化新技术,超高压通过影响维系稳定胶原蛋白结构的氢键等非共价键,从而破坏胶原非共价键,利于后期热处理过程中亚基组分的释放[2,19]。Gómez-guillén等[9,12]采用超高压技术处理鱼皮制备明胶,其研究表明一定的超高压能促进交联的断裂,明显缩短胶原明胶化时间,而且高压可诱导蛋白聚合度增加,增加明胶中高分子质量亚基组分。张宇昊等[10,20]采用超高压辅助提取鱼皮明胶,实验结果表明通过优化超高压作用可显著增加明胶得率,同时提高了其品质:在作用压力300MPa,超高压时间10min,提取温度50～60℃,提取时间4h的条件下,明胶得率最高,达到了75.03%,比传统工艺高了8.9%,凝胶强度可达274g,其原因是鱼皮和猪皮中的胶原的天然构象是由一些非共价键的相互作用来维系的,高压处理会破坏共价键的作用从而导致胶原天然结构改变,因此超高压可以提高明胶得率[21]。

在此基础上,张宇昊[22]对超高压辅助提取猪皮明胶工艺进行了研究,其结果表明:采用低浓度HCl为传压介质的酸/UHP可有效诱导胶原明胶化,在压力250MPa、时间10min、0.75%酸的条件下,明胶得率可达88.62%,凝胶强度可达384.43g,其结果推测超高压与酸结合时,高压不仅可破坏胶原的非共价键平衡,还可促进酸和水分子进入胶原原有的致密疏水空腔,加速酸对胶原分子的作用及水合作用,二者协同增效,促使胶原分子在较短时间内游离出来并溶胀,大大缩短预处理时间;另外超高压处理可促使胶原分子聚合,而以含胶原丰富的猪皮作为明胶提取原料,将更有利于大量的高分子聚合体的形成,而较多高分子量组分的存在则是形成高凝胶强度明胶的关键因素[23]。

2 胶原明胶化过程中特征结构的变化与明胶得率和凝胶强度的关系

从上面可以看出,胶原明胶化过程会发生很多微观结构的变化,不同的明胶化诱导方法,导致的胶原微观结构的变化有一定差异,但总体上,其变化有着一定共同性,主要体现在胶原蛋白三螺旋结构降解和亚基释放[1,24]。陈丽清等[19,22]在用猪皮制备明胶的研究中发现,预处理方法不同,明胶得率提取率差异较大,未经任何预处理组的明胶得率提取率最低,主要因为在胶原保持完整三螺旋结构的前提下对其进行热处理,降解比较困难,且产物分子量分布分散,凝胶特性差,而适宜的酸处理组得率较高,是因为酸诱导明胶化过程对三螺旋结构有一定破坏,导致热处理过程中降解较无预处理组容易,且肽键断裂位点较为均匀,产物分子更加集中。潘杨等[25]采用酸碱法与热水浸提相结合的方法制备鳙鱼鱼鳞明胶,得出最佳的浸酸工艺条件为酸浓度3%,时间6h,最佳浸碱工艺条件为碱浓度3%,时间12h,当酸或碱浓度高于3%明胶提取率会降低,明胶的得率和凝胶强度也会显著降低,此外,预处理时间过长也会产生同样的影响,其原因可能在于酸碱处理过度会造成胶原蛋白三螺旋结构严重破坏,胶原亚基完全暴露在酸碱中造成随机降解进而溶解,导致明胶得率下降,同时亚基组分的降解也导致明胶中高分子亚基组分含量降低,明胶的凝胶强度下降。由此可见通过预处理适当破坏胶原蛋白的三螺旋结构对于获得高得率和高品质明胶至关重要[11,26]。

Fernández-Díaz等[27]采用聚丙烯酰胺凝胶电泳技术分析了以新鲜冷冻鱼皮为原料制备的明胶的亚基组成,发现在-12℃时明胶含有大量α组分,但β和γ组分少,而-20℃没出现这样的情况,间接推测出冷冻诱导胶原分子共价交联,使得胶原亚基的溶解和提取难度更加困难。可见胶原中的共价交联对于明胶提取具有显著影响。Chen等[28]研究了超高压诱导胶原蛋白明胶化过程中压力对明胶得率的影响,证明采用300MPa压力预处理,可获得最高的明胶得率,更高的压力会导致明胶得率的降低,并分析主要原因在于超高压对胶原蛋白中氢键的影响,超高压压力大于300MPa时,可能会导致胶原蛋白中新的氢键形成进而形成聚集体,不利于提胶过程中明胶的释放。由此可见胶原中氢键存在状况同样影响明胶提取。

Eysturskare等[29-30]曾探究了凝胶强度与平均分子量及各组分相对含量的相关性,发现凝胶强度和平均分子量及其分布有一定的相关性,且与α组分、β组分及高分子量组分成正相关,而与低分子量组分(分子量小于α组分)成负相关。陈丽娟等[31-32]研究也表明明胶的α组份含量与胶冻强度(也叫凝胶强度)之间存在线性关系,α1和α2组份含量越高,凝胶强度越高。明胶中亚基组分的含量对明胶的凝胶特性具有很大影响。Chen等[28]研究证明,采用超高压诱导的明胶化胶原,亚基组分含量高于传统酸处理的明胶化胶原,且超高压明胶较传统的酸处理明胶具有更优的凝胶特性,表明明胶中亚基组分同明胶化胶原中的亚基组分含量直接相关。因此,在胶原明胶化过程中,应尽量只破坏维持胶原稳定的高级结构的非共价键平衡,以保持亚基组分的完整性,才能制出高凝胶强度的明胶。

由此可见,研究胶原明胶化过程,三螺旋结构的完整性和亚基组分的含量可作为评价胶原明胶化程度的特征结构。

3 胶原明胶化程度评价方法建立可行性分析

由以上分析可见,胶原的明胶化主要涉及到其特征结构的变化,其变化程度将直接或间接影响到后期提取的明胶的相关指标。因此,对明胶化胶原的三螺旋结构完整性以及亚基组分含量等特征结构进行量化,并结合明胶提取后的得率和凝胶强度等指标,采用回归分析建立模型,即可利用其特征分子结构量化值直接对胶原明胶化程度进行快速评价。模型构建的关键主要在于特征结构的量化和回归模型的选择。

研究表明,三螺旋结构和亚基组分均可被快速测定并予以量化。三螺旋结构可以采用红外光谱或拉曼光谱测定并量化。Li等[33]对热变性、胃蛋白酶处理和超声波胃蛋白酶处理的胶原蛋白的红外光谱分析表明,3330cm-1和 2930cm-1附近分别是酰胺A带和酰胺B带的N-H伸缩振,1636～1661cm-1是酰胺Ⅰ带的C=O伸缩和N-H弯曲振动,1549～1558cm-1是酰胺Ⅱ带C-N 伸缩和N-H弯曲振动,其研究还发现胃蛋白酶处理和超声波胃蛋白酶处理的胶原蛋白的酰胺带的分布和强度一致,而热变性胶原的酰胺带强度降低,说明了热变性胶原蛋白三螺旋结构被破坏。刘苏锐等[34]提取的猪皮Ⅰ型胶原蛋白红外图谱中的1160cm-1附近酰胺Ⅰ带C=O基团的伸缩振动,1550cm-1附近酰胺Ⅱ带N-H弯曲振动以及3340cm-1附近的N-H伸缩振动都表明了肽链氢键的存在,同时说明了猪皮Ⅰ型胶原蛋白三螺旋结构的完整性。Norizah等[35]采用拉曼光谱测定了牛皮明胶和鸡皮明胶的二级结构,并且对明胶各种特征结构进行量化,进而分析了二者的差异。由此可见,由此可见,对三螺旋结构的测定和量化可行。对于亚基组分的研究,通常采用SDS-PAGE进行,Chen等[28]采用SDS-PAGE对不同压力下超高压明胶亚基组分进行测定,并采用Phoretix 1D 软件对亚基组分进行定量和比较,确定了300MPa的处理可以使明胶中亚基组分含量更高。由此可见对于亚基组分量化可行。

回归模型选择方面尚未见报道,从明胶得率以及凝胶强度随酸处理时间变化趋势分析,随着酸处理时间的延长,明胶得率和凝胶强度主要呈现先上升,后下降或者区域平稳的趋势[10,36-38]。本课题组初步研究表明[39],随着酸处理时间延长胶原蛋白的三螺旋结构含量呈现下降趋势,但后期下降趋势有所放缓;此外,胶原的亚基组分随着酸处理时间的延长同样呈现下降趋势。由此推断,在特征结构与明胶得率和凝胶强度模型构建时,Linear、Llogarithmic、Quadratic、Cubic等模型有可能会有较高的相关性。

综上所述,明胶化胶原中三螺旋结构、氢键和亚基组分均可被快速测定并予以量化,将其同明胶得率和凝胶强度构建回归模型,有望快速预测不同明胶化程度胶原用于提胶后,所得明胶的得率和凝胶强度。因此,建立胶原明胶化程度快速评价方法具有可行性。

4 展望

明胶作为一种非常重要的天然生物高分子材料,被广泛应用于食品、照相、医药等领域。传统的明胶生产工艺存在耗时长、效率低、污染环境等缺点,严重阻碍了明胶的产业化发展,因此明胶化改进工艺成为了研究热点,但其评价方法主要依据最终产品的得率与特性,这个操作需要完成整个明胶制备过程,耗时费力,成本较高。因此建立新型明胶化快速评价方法对明胶产业的发展有着重要意义。

明胶化胶原的特征结构会影响明胶提取后的相关指标,其中三螺旋结构、氢键和亚基组分均可被快速测定并予以量化,如果将明胶化胶原的特征结构结合明胶的得率、凝胶强度等指标构建预测模型,有望用于不同明胶化程度胶原在提胶后所得明胶指标的预测。

总的来说,直接根据明胶化胶原的特征分子结构来评价明胶化程度比热力提胶后再根据明胶相关指标更节约时间和成本,并有望通过研究明胶化胶原的特征结构来控制预处理条件以提高明胶的得率和品质。结合明胶化胶原特征分子结构和后期相关指标建立基于特征分子结构的胶原明胶化程度评价方法具有重要意义,可为明胶的工艺改进乃至明胶产业的升级提供帮助。

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Analysis and prospect on rapidly evaluated systemfor gelatinization of collagen

ZHAO Ge1,KANG Yang-fei1,LIU Jin-ning1,ZHANG Yu-hao1,2,*

(1.College of Food Science,Southwest University,Chongqing 400715,China;2.National Food Science and Engineering Experimental Teaching Center,Southwest University,Chongqing 400715,China)

Gelatin yield and gel strength are the main evaluation indicators of the gelatinization degree of collagen,but the value measured must complete gelatinization of collagen and hot water extraction two process. Therefore,it can greatly save research time and costs that directly evaluate the gelatinization degree of collagen with the typical structure of the collagen. According to variation of microstructure of collagen treated by traditional acid-alkali,enzyme and ultra-high pressure,relationship between typical structures of gelatinized collagen and main evaluation indicators were discussed. Meanwhile,the evaluated methods based on the typical microstructure for gelatinization of collagen were analyzed and predicted.

gelatin;collagen;gelatinization;microstructure;rapid evaluation

2014-06-12

赵格(1992-)，女，本科在读，研究方向:食品质量与安全。

*通讯作者:张宇昊(1978-)，男，博士，副教授，研究方向:蛋白质与生物活性肽。

“国家大学生创新创业训练计划”项目(201310635011)；国家自然科学基金项目(31301425)；中央高校基本科研业务费重点项目(XDJK2011B001)；中国博士后基金面上项目(2014M562267)。

TS209

A

1002-0306(2015)05-0370-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.05.070