肺癌细胞A549 Livin基因在常见化疗药物作用下的表达和对细胞增殖的影响

陆乘俊　孙超

摘要：目的 研究化疗药物对人肺细胞癌A549抑制基因Livin基因的影响。方法 将不同化疗药物浓度按100、50、25、12.5、6.25、、3.13、1.56、0.78ug/ml，与A549共同培养，分别作用24、48、72h，MTT检测细胞凋亡结果；real time PCR检测Livin mRNA的表达，以及Western blots检测Livin蛋白的变化。结果 不同浓度化疗药物与A549培养后，细胞凋亡率与化疗的浓度增加而升高以及Livin基因的表达也明显的改变（P<0.01）。结论 化疗药物通过抑制肺癌细胞A549 Livin基因表达，抑制细胞增殖，促进细胞凋亡。

关键词：化疗药物；肺癌细胞；Livin基因

随着吸烟人群的增加（包括吸入二手烟）及大气污染的加重，肺恶性肿瘤的发病率逐年增加；治疗目前除手术切除外，主要为化疗与放疗，但化疗药物的耐受性往往影响化疗药物的疗效；目前研究发现Livin基因与肿瘤的耐受性有一定的关系[1，2]，因此，我们选用常见的化疗药物作用于肺癌细胞株，观察Livin基因表达的改变，探讨Livin基因与细胞凋亡的相互关系。

1资料与方法

1.1一般资料 江苏省无锡市人民医院肿瘤科提供化疗药物依托铂苷、卡铂、多柔比星。中科院上海生化与细胞生物学研究所提供人肺癌细胞株（A549）。

1.2实验用仪器与试剂 96孔细胞培养板（Costar， Denmark）；细胞培养箱（NAPCO，USA）；倒置相差显微镜（OLYMPUS，JAPAN）。DMEM培养基（GIBCO，USA）（每L含10%小牛血清、L-谷氨酰胺0.33mg，青霉素100U、链霉素100U、pH7.4）；胰蛋白酶（MERCK，USA）；二甲基亚砜（DMSO）（Merck，Germany），无水乙醇（分析纯，上海振兴化学试剂厂，批号：20021200365）；Livin（abcam USA）、碘化丙啶（PI） （Sigma，USA），南京生物工程公司提供引物。

1.3 方法

1.3.1体外培养实验用细胞株 用含10%小牛血清的DMEM培养液培养、传代人肺癌细胞株（A549）。

1.3.2 实验分组 正常对照组；依托铂苷、卡铂、多柔比星浓度按100、50、25、12.5、6.25、3.13、1.56、0.78ug/ml，与A549共同培养，分别作用24、48、72h。

1.3.3 MTT法检测化疗药物对细胞活力的影响 使用0.25%胰酶消化培养至第3代的各组A549细胞后，吹制成单个细胞悬液（细胞密度为1.0×104），分别接种到96孔板中（不含细胞的血清（为消除血清物质对光吸收值的影响）（1～2列）、空白组细胞悬液（3～4列）；模型组细胞悬液（5～6列）；不同浓度的测试药物组细胞悬液（7～12列）），于37℃、5%二氧化碳的培养箱放置并作用24h、48h、72h后，每孔再加入MTT溶液20ul，继续孵育4h后终止培养。小心吸弃上清液，小孔加入DMSO 200μl溶解结晶物并振荡10min后在酶标仪上测定各孔的吸光值。

1.3.4 RT-PCR 检测Livin mRNA的表达 根据美国NCBI 的Genbank 提供的Livin 和β-actin mRNA 序列， 设计引物序列如下： ①LivinSense： 5′-TGAGGAGTTGCGTCTGGC-3′；Antisense： 5′-GGCTGCGTCTTCCGGTTC-3′。②β-actin（BC004251） Sense： 5′-CTTAGTTGCGTTACACCCTTTC-3′； Antisense： 5′-CACCTTCACCGTTCCAGTTT-3′。PCR应体系均为15ul，其中含cDNA模板2.5ul，SYBR Green 7.5ul，引物 0.6ul，去离子水4.4ul，95℃预变性5min，94 ℃45sec，56℃45sec，72 ℃50sec，35个循环；比较Ct法（△△Ct法）分析结果。

1.3.5蛋白印迹（Western blots） 分析 常规细胞蛋白质的提取、定量， SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离。湿转法转膜后先后与5%BSA、一抗（浓度1∶1 000）、过氧化物酶偶联的二抗（浓度1∶10 000） 孵育， 运用ECF化学发光显影、荧光图像扫描仪扫描存入电脑。

1.4数据分析 运用SPSS13.5统计软件，以均数±标准差表示，采用单因素方差分析及t检验。

2结果

2.1对A549细胞凋亡的改变 实验结果提示，A549细胞经化疗药物作用后，细胞的抑制明显增高（P<0.01），并有剂量依赖性以及时间依赖性（见图1～图3）。

2.2各化疗药物组细胞Livin mRNA的表达 RT-PCR结果显示，化疗药物多柔比星、卡铂与A549细胞分别作用24h、48h后，Livin 基因表达量呈逐渐下降趋势， 且浓度越高， 时间越长， 则表达量越少；72h后 Livin基因的表达量有增高趋势；而依托铂苷分别作用24、48、72h后， Livin 基因的表达量均呈逐渐下降趋势， 且其幅度随药物浓度的增加而增加（图4）。

2.3各化疗药物对A549细胞的Livin蛋白的影响 化疗药物采用IC50 的抑制浓度， 分别作用于A549细胞 24h、48h、72 h。化疗药物多柔比星、卡铂作用细胞24h、48h，Livin 蛋白表达量呈逐渐下降；72h Livin蛋白表达量有增高趋势；依托铂苷作用72 h 后， Livin 蛋白的表达均逐渐下降， 且其幅度随药物浓度的增加而增加（图5）。

3讨论

肺癌目前是全世界肿瘤死亡原因的第一位。近年来，认识到大多数化疗药物是通过诱导细胞凋亡、抑制肿瘤细胞的增殖而实现治疗作用。Livin 基因位于染色体20q13.3， 全长46 kb， 包含7 个外显子和6 个内含子，它有两种异构体：Livinα 和Livinβ。Livin 基因在胎盘和发育中的组织以及黑色素瘤、白血病、胃癌、肝癌、肺癌、乳腺癌、结肠癌等一些肿瘤组织中特异性高表达， 而在大多数正常组织中不表达或仅有少量表达[3，4]，并且有研究认为，癌症患者放化疗的耐药与Livin基因的表达水平有关[5]。Livin基因可以通过抗死亡受体途径、抗线粒体途径和激活JNK1 信号转导等途径发挥抑制细胞凋亡和抵抗肿瘤放化疗作用[6]。

实验结果显示，A549经化疗药物多柔比星、卡铂作用后，Livin基因表达初期呈降低， 但随化疗药物作用时间的增加，Livin基因表达呈明显上升；Livin基因早期不仅通过与procaspase-9直接结合抑制其活性，还可以通过抑制caspase-3 的活性， 阻断其对procaspase-9 的正反馈激活，从而介导细胞凋亡通路；此外后期Livin基因作为一种酶抑制剂，通过BIR -结构域结合凋亡过程中激活的核心物质Caspases蛋白（如Caspase-3、Caspase-7 等）介导Caspases蛋白的失活和降解而发挥抗凋亡的作用；Livin基因表达规律与MTT检测的细胞活力结果一致。依托铂苷与Livin基因表达呈量效关系，作用效果优于多柔比星及卡铂，在临床上可以减少肿瘤细胞的耐受性。

综合上述，对于非小细胞肺癌，Livin基因可能通过调节肿瘤细胞的凋亡影响肿瘤的转归， 并可能为肺癌诊断和治疗提供新的方向。

参考文献：

[1]Gazzaniga P， Gradilone A， Giuliani L， et al. Expression and prognostic significance of LIVIN， SURVIVIN and other apoptosis-related genes in the progression of superficial bladder cancer[J].Ann Oncol， 2003， 14（ 1） ：85- 90.

[2]Yagihashi A，Asanuma K，Tsuji N，et al.Detection of anti-Livin antibody in gastrointestinal cancer patients[J] .Clin Chem， 2003，49 （ 7） ： 1206-1208.

[3]Vucic D， Stennicke H R， Pisabarro M T， et al. ML-IAP，a novelinhibitor of apotosis that a preferentially expressed in humanmelanamas [J]. Curr Biol，2000，10（21）：1359-1366..

[4]Choi J， Hwang Y K， Sung K W， et al. Expression of Livin， an antiapoptotic protein， is an independent favorable prognostic factor in child acute lymphoblastic leukemia [J].Blood，2007，109 （2）：471-477.

[5]Crnkovic-Mertens I， Hoppe-Seyler F， Butz K. Induction of tumor cells by siRNA-mediated silencing of the Livin / ML-IAP/ KIAP gene[J]. Oncogene，2003，22（51）：8330-8335.

[6]Chang H， Schimmer AD. Livin/melanoma inhibitor of apoptosis protein as a potential therapeutic target for the treatmentof malignancy [J]. Mol Cancer Ther， 2007， 6： 24-30.

编辑/申磊