经方鳖甲煎丸抑制H22肝癌细胞血管生长的实验研究*

汤新跃

广东省第二人民医院肿瘤二科 (广州 510317)

经方鳖甲煎丸抑制H22肝癌细胞血管生长的实验研究*

汤新跃

广东省第二人民医院肿瘤二科 (广州 510317)

目的：探讨经方鳖甲煎丸对H22肝癌细胞荷瘤小鼠血管生长的抑制效果，为鳖甲煎丸在肝癌治疗的临床应用提供动物实验理论依据。方法：选用120只昆明小鼠，以H22肝癌细胞建立H22荷瘤小鼠动物模型，随机分为A组、B组、C组和D组各30例，A组为高剂量鳖甲煎丸灌胃服用，B组为低剂量鳖甲煎丸灌胃服用，C组为环磷酰胺注射液腹腔注射，D组为阴性对照组，连续用药15d后将其处死，剥离瘤块并检测肿瘤组织的微血管计数和血管内皮生长因子表达阳性的细胞面积占肿瘤细胞面积的比例并进行对比。结果：A组小鼠的微血管计数结果为(4.08±1.32)条，显著少于其余三组小鼠(均P<0.05)；B组小鼠的微血管计数结果为(7.72±1.51)条，显著少于C组和D组小鼠(均P<0.05)；A组小鼠的血管内皮生长因子表达阳性细胞所占面积为(2.32±1.08)%，显著少于其余三组小鼠(均P<0.05)；B组小鼠的血管内皮生长因子表达阳性细胞所占面积为(5.61±1.42)%，显著少于C组和D组小鼠(均P<0.05)，C组小鼠的血管内皮生长因子表达阳性细胞所占面积为(9.21±3.36)%，显著少于D组小鼠(P<0.05)。结论：鳖甲煎丸可显著降低H22荷瘤小鼠肝癌组织血管内皮生长因子的表达，抑制新生微血管的生成，进而对肿瘤组织的生长和转移有一定的抑制作用。

鳖甲煎丸出自于张仲景的《金匮要略》，其方药组成较多，具有平调寒热、攻补并用、软坚散结、行气化瘀的作用。《金匮要略》中以疟病日久引起的疟母、癥瘕为其主治证。然而，随着现代研究的深入，鳖甲煎丸的临床应用得到了不断的扩展，目前已经有应用鳖甲煎丸治疗肝硬化、肝吸虫等，同时也有动物试验证实，鳖甲煎丸具有一定的抗肝纤维化、肾间质纤维化的作用[1-2]。在肿瘤的治疗上，鳖甲煎丸也有治疗肝癌的报道，且取得一定的临床疗效[3]。然而，由于本方所包含的方药较多，且用法较为独特，而其治疗肝癌的报道多为个案研究，较少药理及动物实验的数据支撑，这将直接影响鳖甲煎丸进一步临床应用。本研究观察鳖甲煎丸对H22肝癌细胞血管生长的抑制效果，为鳖甲煎丸在肝癌治疗上的临床应用提供现代动物实验理论依据。

1 实验材料和方法

1.1 主要试验材料 本研究所用120只雄性昆明种小鼠均由广州中医药大学实验动物中心提供，小鼠体重为18～22g。随机将上述小鼠分为A组、B组、C组和D组各30只。H22荷瘤小鼠模型则由中山医科大学肿瘤研究所提供。本研究所用鳖甲煎丸由武汉中联药业集团股份有限公司提供，国药准字Z42020772，环磷酰胺注射液由江苏恒瑞医药股份有限公司提供，国药准字H32020856。

1.2 主要试剂 血管内皮生长因子一抗、生物素标记兔抗山羊二抗均由上海安研生物有限公司提供，SABC免疫组化试剂盒由武汉博士德生物工程有限公司提供。

1.3 研究方法 将接种了10dH22肝癌细胞的小鼠以颈椎脱臼法处死，蜡板固定后，将其腹腔内的腹水抽出。以相同体积的0.9%氯化钠注射液将抽出的腹水稀释后，采用0.2%台盼蓝染色，将肿瘤细胞悬液的浓度调整为6×106/mL。然后抽取0.2mL于每只小鼠的右后肢皮下注射，接种完成后24h开始各组小鼠给药。鳖甲煎丸悬液的制备采用蒸馏水和鳖甲煎丸配制而成。分别配制浓度为0.024g/mL和0.048g/mL两种浓度的鳖甲煎丸悬液，配制完成后，储存于4℃的环境中备用。A组小鼠按照每天每公斤12g的剂量灌胃服用鳖甲煎丸悬液，B组小鼠按照每天每公斤体重6g的剂量灌胃服用鳖甲煎丸悬液，C组小鼠每天按照每公斤体重20mg的剂量腹腔注射环磷酰胺注射液，D组小鼠每天蒸馏水灌胃。四组小鼠均按照各自方案用药15d后处死，剥离肿瘤后称重，并检测肿瘤的相关指标。

1.4 观察指标 分别检测瘤块内的微血管计数和血管内皮生长因子的水平。瘤块内微血管计数的检测方法如下：分别在每组小鼠瘤体的不同部位取出5个体积为5mm×5mm×2mm的标本，取标本时注意避开出血部位和边缘反应区。所取的标本经过HE染色，现在40倍显微镜下标记血管计数最高的3个区域，然后通过100倍显微镜在相应区域计数，统计每个高倍镜视野中的微血管计数。计算微血管数目时，对于有较厚血管平滑肌或者管腔面积超过8个红细胞面积的血管忽略不计，这样可避免较大的血管影响计数的准确性。以5个部位计数结果的平均值为最终的微血管计数结果。血管内皮生长因子水平的检测方法如下：瘤块剥离后，经过固定、脱水、浸蜡、包蜡、切片5个步骤处理后，采用SABC免疫组化试剂盒对其血管内皮生长因子水平进行检测。如果细胞的胞质、胞膜有棕黄色着色的判定为阳性细胞。以切片细胞着色明显的区域取10个高倍视野进行计数，计算每个高倍视野中100个肿瘤细胞中，阳性细胞所占的比例。以细胞浆内有棕黄色为血管内皮生长因子阳性的判定标准，计算血管内皮生长因子阳性的细胞面积和肿瘤细胞面积的比值。对比四组小鼠的肿瘤微血管计数和血管内皮生长因子的检测结果。

2 结 果 2.1 四组小鼠肿瘤组织微血管计数检测结果的对比 A组小鼠的微血管计数结果为(4.08±1.32)条，显著少于其余三组小鼠(均P<0.05)；B组小鼠的微血管计数结果为(7.72±1.51)条，显著少于C组和D组小鼠(均P<0.05)，见表1。

表1 四组小鼠肿瘤微血管计数检测结果的对比

注：和A组对比，△P<0.05，和B组对比，▲P<0.05

2.2 四组小鼠肿瘤组织血管内皮生长因子检测结果的对比 A组小鼠的血管内皮生长因子表达阳性细胞所占面积为(2.32±1.08)%，显著少于其余三组小鼠(均P<0.05)；B组小鼠的血管内皮生长因子表达阳性细胞所占面积为(5.61±1.42)%，显著少于C组和D组小鼠(均P<0.05)，C组小鼠的血管内皮生长因子表达阳性细胞所占面积为(9.21±3.36)%，显著少于D组小鼠(P<0.05)，见表2。

表2 四组小鼠肿瘤组织血管内皮生长因子检测结果的对比

注：和A组对比，△P<0.05，和B组对比，▲P<0.05，和C组对比，◇P<0.05

3 讨 论 鳖甲煎丸是目前临床较为常用经方，近年来的临床报道显示，本方可用于肝纤维化、慢性肝炎、肝硬化等的治疗中，同时在肝癌、胃癌等抗肿瘤的治疗中，也证实具有较为肯定的疗效[4-5]。然而，目前的临床研究多为单纯的案例报道，缺乏现代药理或者实验动物数据作为理论支撑，这将使鳖甲煎丸的广泛应用受到限制。本研究试图通过动物实验的研究，为鳖甲煎丸在肝癌的治疗上提供实验数据支持。

临床研究已经证实，恶性肿瘤的侵袭力与新生血管的产生有直接的关系，马晨光[6]的研究显示，血管内皮生长因子的浓度和胸部恶性肿瘤的恶性行为有密切的关系。林道浙等[7]的研究也证实，血管内皮生长因子浓度的检测可用于评估肝癌的生物学行为和患者的预后。由于恶性肿瘤的代谢旺盛，其增殖、转移均需要新生血管提供充足的血液供应，以保证肿瘤细胞的营养需求。血管内皮生长因子则在诱导肿瘤新生血管的产生上发挥了重要的作用，因此，检测血管内皮生长因子的浓度有助于评估肿瘤的恶性程度和增殖的活跃程度[8]。本研究的结果证实，经过高剂量鳖甲煎丸悬液喂养的小鼠，其微血管计数和血管内皮生长因子表达阳性的细胞面积均最少，而低剂量鳖甲煎丸悬液喂养小鼠的微血管计数和血管内皮生长因子表达阳性的细胞面积也显著低于单纯环磷酰胺注射液腹腔注射的小鼠。这说明鳖甲煎丸能够有效抑制血管内皮生长因子的表达，进而抑制肝癌组织新生微血管的生成，这与郑艳等的研究结果基本一致[9]。同时，鳖甲煎丸服用剂量的增加能够增强其抑制肝癌组织新生微血管生成的作用。由于肿瘤组织的血管密度越高，肿瘤细胞经进入血循环而发生转移的风险越大，鳖甲煎丸的应用显著抑制了微血管的生成，这不仅对肿瘤组织的生长有一定的抑制作用，同时也降低了肝癌细胞发生血行转移的风险。罗庆东等[10]的动物实验研究也证实，鳖甲煎丸可下调血管内皮生长因子及其受体的表达，进而对肿瘤的转移有抑制作用。

综上所述，鳖甲煎丸可显著降低H22荷瘤小鼠肝癌组织血管内皮生长因子的表达，抑制新生微血管的生成，进而对肿瘤组织的生长和转移有一定的抑制作用。

[1] 李志刚,谷 宁.阿德福韦酯联合鳖甲煎丸治疗活动性乙型肝炎肝硬化疗效观察[J].医学信息,2012,25(7):280-281.

[2] 文 彬,贺松其,庞 杰，等.鳖甲煎丸对肝纤维化大鼠作用机制研究[J].中国中西医结合消化杂志,2013,21(11):572-575.

[3] 王 涵.鳖甲煎丸治疗肝癌体会[J].内蒙古中医药,2012,31(4):22.

[4] 罗庆东,姜德友.鳖甲煎丸的临床研究与进展[J].齐齐哈尔医学院学报,2012,33(6):764-766.

[5] 王 兵,侯 炜.《金匮要略》三丸方治疗肿瘤探讨[J].中医学报,2013,28(10):1451-1453.

[6] 马晨光.血管内皮生长因子检测在胸部恶性肿瘤中的临床意义[J].中国医师进修杂志,2011,34(29):58-60.

[7] 林道浙,郑一双,李克诚，等.结直肠癌患者门静脉血中血管内皮生长因子浓度与肝转移的关系[J].上海医学,2011,34(12):957-958.

[8] 李 丁,向 华.血管内皮生长因子在原发性肝癌中的诊断及预后意义[J].介入放射学杂志,2014,23(11):1018-1021.

[9] 郑 艳,贺松其,文 彬,等.鳖甲煎丸对HUVEC增殖及HepG2中VEGF表达的影响[J].中国实验方剂学杂志,2014,20(20):132-136.

[10] 罗庆东,王月飞,赵红晔，等.鳖甲煎丸对肝癌荷瘤小鼠肿瘤组织生长及转移的影响[J].中国实验方剂学杂志,2012,18(14):230-232.

(收稿2015-03-08；修回2015-04-06)

*广东省中医药管理局科研立项(20131106)

肝肿瘤/中医药疗法 @鳖甲煎丸 动物，实验 小鼠

R735.7

A

10.3969/j.issn.1000-7369.2015.07.083