传统四川泡菜发酵过程中酵母菌分离鉴定

刘春燕,戴明福,夏 姣,徐 林,沈丽雯,蒲 彪，*

(1.四川农业大学食品学院，四川雅安 625014;2.浙江工业大学政治与公共管理学院，浙江杭州 310023)



传统四川泡菜发酵过程中酵母菌分离鉴定

刘春燕1,戴明福2,夏 姣1,徐 林1,沈丽雯1,蒲 彪1，*

(1.四川农业大学食品学院，四川雅安 625014;2.浙江工业大学政治与公共管理学院，浙江杭州 310023)

以红皮萝卜为原料,分别用自然发酵法、老泡菜水发酵法泡制四川泡菜,采用传统的分离培养方法、26S rDNA序列测定技术,研究不同发酵时期各泡菜水中的酵母菌群分布及动态变化。研究结果表明,发酵过程中共存在5种酵母菌,经鉴定其依次为清酒假丝酵母菌(Candidasake)、掷孢酵母(Sporisoriucamicdor)、胶红酵母(Rhodotorulamucilaginosa)、毕赤酵母属galeiformis(Pichiagaleiformis)、酒酵母(Kazachstaniaexigua)。对发酵过程中动态分析表明:Pichiaspp.、Kazachstaniaspp.为传统发酵泡菜中主要的酵母菌。此外,两种不同发酵方式发酵过程中出现的酵母菌种类不同,但动态变化趋势大致相同。

四川泡菜,酵母菌,26S rDNA,动态变化

泡菜是一种以新鲜蔬菜为原料,利用低浓度盐水或少量食盐进行泡制或腌制,且以乳酸菌发酵为主[1],兼有酒精发酵、醋酸发酵等过程而制成的具有特殊风味的微生物发酵食品。其中乳酸菌发酵产生大量的有机酸,酵母菌发酵产生大量的醇类风味成分[2],传统四川泡菜味道咸酸爽口,自然清纯,制作过程简单,深受广大消费者喜爱。

酵母菌(Yeast)是一种在有氧和无氧环境下都能生存,属于兼性厌氧菌,且能发酵糖类产能的单细胞真菌。发酵蔬菜中的酵母菌主要有异常汉逊酵母(Hansenulaanomala)、德氏酵(Debaryomyces)、红酵母(Rhodotorulaglutinis)、易酒香酵母(Brettanomycesanomalus)等十几个种[3]。Ho-Won Chang[4]等对韩国泡菜中的Lodderomycesspp.,Trichosporonspp.,Candidaspp.,等酵母菌进行了分离鉴定。由于泡菜原料未经过灭菌处理,因此在后期发酵过程中一旦环境温度升高或者存放条件不利,泡菜中的腐败微生物就会大量滋生,这样在泡菜泡渍过程中容易出现“生化”等腐败变质现象,影响泡菜品质。敖晓琳等[5]对引起泡菜“生化”腐败的微生物进行了分离鉴定,得到2株真菌P.manshurica。张鹏[6]从3种优质四川泡菜里分离鉴定出Candidavalida和Candidaparapsilosis。本实验对传统四川泡菜发酵过程中存在的酵母菌进行分离鉴定,旨在分析泡菜发酵过程的酵母菌菌群及动态变化,为进一步研究泡菜中酵母菌对泡菜产品品质的影响机理提供一定的理论依据。

表1 菌落形态特征及个体特征Table 1 Colony morphology and microscopy morphology

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

新鲜红皮萝卜 雅安市售;老泡菜水 四川农业大学食品学院实验室提供。

2×PCR Master Mix、Fungal DNA Kit真菌DNA提取试剂盒(D3390-01) 美国Omega Bio-Tek有限公司;所用其他生化试剂均为分析纯。

玉米粉琼脂培养基、YPD培养基、PDA培养基、孟加拉红培养基、豆芽汁培养基[7],为了在筛选过程中排除细菌的干扰,在培养基中加 100mg/L 的氯霉素。

SW-CJ-IF单人双面超净工作台 苏净安泰空气技术有限公司;Powerpac Basic 电泳仪、Universal HoodⅡ凝胶成像系统、MycyclerTMThermal Cycler PCR仪 美国BIO-RAD公司;CX21S1电子显微镜 日本OLYMPUS公司;YXQ.SG41.280高压蒸汽灭菌锅 上海华线医用核子仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 泡菜汁中酵母菌的分离筛选 取不同发酵时期的泡菜液作梯度稀释后,分别涂布于PDA、YPD、孟加拉红固体培养基,于28℃恒温培养箱中培养2～5d后,根据在不同培养基中的菌落形态进行初步分类,挑取形态不同的单菌落再于YPD培养基上划线,纯化2次,观察菌落形态,确定为单菌落后将所分离的酵母菌转接于试管斜面,于4℃冰箱保存[8]。

1.2.2 菌株的生理生化鉴定 生化鉴定方法参照《真菌鉴定手册》[9]及《酵母菌的特征与鉴定手册》[10],根据菌株的培养形态特征及生理生化特性初步确定其分类地位。

1.2.3 菌株的分子学鉴定 用试剂盒提取菌株的总DNA,以NL1、NL4为引物对菌株进行26S rDNA D1/D2区序列分析。其引物序列:正向引物NL1:5′-GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3′;反向引物NL4:5′-GGTCCG TGTTTCAAGACGG-3′[11-12]。

PCR扩增体系:2 × PCR Master Mix 12.5μL、引物各1μL、模板DNA 1μL、ddH2O补至25μL。

PCR扩增程序:94℃预变性5min;94℃变性1min,55℃退火1min,72℃延伸1min,共36个循环;最后72℃延伸10min。

PCR扩增产物用1%琼脂糖凝胶电泳检验,目的片段长度在600bp左右。PCR扩增产物送华大基因测序。

1.2.4 系统发育树分析 将菌株的26S rRNA基因序列提交到GenBank 核酸序列数据库并与数据库中已知的相关序列进行比较,将相似度高的序列与测定序列通过Clustalx 进行多重序列比对,比对结果用MEGA软件中的Neighbor-Joining法构建系统发育树[13]。

1.2.5 酵母菌种类动态分析 分别取自然发酵、老泡菜水发酵1、2、3、4、5、6、7、8、9d的红皮萝卜泡菜水进行酵母菌的动态分析。取合适稀释度的泡菜水涂布于YPD平板上,于28℃恒温培养箱培养2～5d后观察菌落形态,并对菌落形态进行记录。

2 结果与分析

2.1 菌株的形态特征

对挑取的 124个酵母菌株进行初步的形态学鉴定,最终归纳出5株形态不同的酵母菌,将其分别编号为:Y-1、Y-2、Y-3、Y-4、Y-5。上述各菌株的菌落及细胞主要形态特征如表1所示,照片见图1。

图1 菌落形态特征及个体特征(100×)Fig.1 Colony morphology and microscopy morphology(100×)

在形态学分类的基础上,对以上5株酵母菌进行初步的生理生化特性实验,如表2所示。

对实验菌株的形态学和生理生化特性进行分析,Y-2发酵葡萄糖、半乳糖时可变,不进行尿酶发酵和产淀粉酶发酵。Y-4不能发酵糖类及硝酸盐类,在37℃生长时可变,根据以上的生理生化特性并不能将其准确的鉴定出来。

2.2 26S rDNA鉴定

提取的实验菌株基因组DNA用1%琼脂糖电泳检测,得到了一条明显的亮带,说明所采用提取DNA的方法准确有效。将所得DNA作为模板进行26S rDNA PCR扩增,扩增产物中有600bp目的条带,且清晰可见,无杂带,可用于菌株26S rDNA测序。供试菌基因组PCR扩增产物电泳图见图2。

表2 菌株生理生化特性Table 2 Physico-chemical characteristics

注:+表示阳性;-表示阴性;V表示可变反应。

表3 酵母菌的动态变化Table 3 Dynamic change of Yeast

图2 26S rDNA扩增产物电泳结果Fig.2 Elctrophoresis of amplification products of 26S rDNA

测序结果在NCBI基因序列数据库通过BLAST进行序列比对,将同源性较高的典型菌株的序列用于构建系统发育树。结果见图3。

图3 26S rDNA系统发育树 Fig.3 Phylogenetic tree derived from 26S rDNA sequences

由构建的系统发育树来看,实验分离的菌株均属于酵母菌属,其中Y-1与Candidasake(JX880410.1)和Candidasake(KF912818.1)及Pichiagaleiformis(JX880398.1)聚在一起,因此Y-1可能为清酒假丝酵母或毕赤酵母属,结合Y-1的生理生化特性将其鉴定为清酒假丝酵母。Y-2与Pichiamanshurica(JQ419830.1)和Pichiagaleiformis(JX880398.1)聚在一起,且它们的同源关系的可信度达到99%以上,因而Y-2被鉴定为毕赤酵母属。Y-3与Sporobolomycescarnicolor(AY070008.1)聚在一起,被鉴定为掷孢酵母属。Y-4与Rhodotorulamucilaginosa(KC160605.1)聚在一起,为胶红酵母属。而Y-5与Kazachstaniaexigua(KF241562.1)和Kazachstaniaexigua(EU020099.1)聚在一起,同源关系的可信度达到99%以上,其为酒酵母属。

分离菌株Y-1、Y-2、Y-3、Y-4、Y-5的26S rDNA序列已注册到NCBI数据库,其登录号依次为KJ999789、KJ999790、KJ999793、KJ999791、KJ999792。

2.3 不同泡菜中酵母菌的动态变化

对不同发酵方式(自然发酵、老泡菜水发酵)泡菜泡制过程中酵母菌种类及动态变化进行记录:Y-1(Candida.spp.)、Y-3(Sporobolomyces.spp.)是老泡菜水发酵泡萝卜中特有的酵母菌,在自然发酵泡萝卜中未检测到;而Y-2,Y-4,Y-5为两种泡菜共有;且自然发酵泡萝卜在发酵第3d泡菜水中的酵母菌逐渐消失,第4d Y-2、Y-5又出现;发酵第5d后自然发酵泡菜中只检测到Y-5,老泡菜水发酵中只有Y-2。此外,两种不同发酵方式发酵过程中出现的酵母菌种类不同,但动态变化大致相同,这是因为自然发酵泡菜中微生物主要来自蔬菜原料表面,而老泡菜水发酵泡菜中的微生物除附着在蔬菜本身的微生物外,还有老泡菜水所特有的稳定的微生物体系。

2.3.1 泡菜中酵母菌的种类分析 对于泡菜中微生物的研究,主要集中在对发酵起主要作用的乳酸菌区系[14],酵母菌的研究相对较少,而对传统发酵过程中酵母菌的研究还未见报道。本实验首次对传统发酵泡菜中酵母菌的动态变化进行分析。

实验从两种不同发酵方式泡制泡菜发酵过程中分离到五种酵母菌,分别是清酒假丝酵母菌(Candidasake)、毕赤酵母属galeiformis(Pichiagaleiformis)、掷孢酵母(Sporisoriucamicdor)、胶红酵母(Rhodotorulamucilaginosa)、酒酵母(Kazachstaniaexigua)。张兰威等[15]、贺稚非等[16]分别从腌渍蔬菜和发酵蔬菜低温贮藏过程中分到了Candidaparapsilosis,关于从泡菜中分离到Candidasake未见报道。Pichiagaleiformis、Kazachstaniaexigua是泡菜中主要的酵母菌,这与Ho-Won Chang[4]、敖晓琳[5]、曾骏[17]等的研究结果一致。而从泡菜中分离出Sporisoriuspp.、Rhodotorulaspp.未见报道,可能是由于它们不是泡菜中的主要酵母菌,其出现的时间较短所致。

2.3.2 酵母菌动态分析 实验分离所得的五株菌在泡菜发酵过程中进行动态分析,泡制后立即取样分离到Y-2、Y-3、Y-4、Y-5四株菌,24h后Y-3、Y-4迅速消失,同时在老泡菜水发酵泡菜中出现Y-1,且出现后随即消失。这可能是因为发酵启动后乳酸菌为主要的发酵优势菌,其大量产生有机酸使得微生物体系整体处于酸性环境中,Y-3、Y-4耐酸性差,因而死亡消失;在老泡菜水发酵过程中Y-2始终可以检出,这说明Y-2不是原料本身携带,而是来自老泡菜水,且稳定存在于老泡菜水中;自然发酵泡萝卜发酵第3d泡菜水中未检测到酵母菌,第4d Y-5出现,直至发酵结束都能检测到Y-5。对于自然发酵过程中酵母菌消失又出现的原因目前还不清楚,有待于进一步的研究。Y-5又出现说明其耐酸,且可能与乳酸菌之间形成稳定的相互作用。

3 结论

实验从两种不同发酵方式泡制泡菜发酵过程中分离到五种酵母菌,分别为清酒假丝酵母菌(Candidasake)、毕赤酵母属galeiformis(Pichiagaleiformis)、掷孢酵母(Sporisoriucamicdor)、胶红酵母(Rhodotorulamucilaginosa)、酒酵母(Kazachstaniaexigua)。其中毕赤酵母属galeiformis、酒酵母为传统发酵泡菜中主要的酵母菌。此外,两种不同发酵方式发酵过程中出现的酵母菌种类不同,但动态变化趋势大致相同。

[1]Kim M,Chun J. Bacterial community structure in kimchi,a Korean fermented vegetable food,as revealed by 16S rRNA gene analysis[J]. International Journal of Food Microbiology,2005,103(1):91-96.

[2]Garnder N J,Savard T,Obermeier P,et al. Selection and characterization of mixed starter cultures for lactic acid fermentation of carrot,cabbage,beet and onion vegetable mixtures

[J]. International Journal of Food Microbiology,2001,64(3):261-275.

[3]Brian J B Wood.主编.徐岩译.发酵食品微生物学[M]. 北京:中国轻工业出版社,2001：42.

[4]Ho-Won Chang,Kyoung-Ho Kim,Young-Do Nam et al. Analysis of yeast and archaeal population dynamics in kimchi using denaturing gradient gel electrophoresis[J]. International Journal of Food Microbiology,2008,126(12):159-166.

[5]敖晓琳,蔡义民,夏姣,等.引起泡菜“生花”的腐败微生物的分离鉴定[J]. 食品科学,2013(21):204-208.

[6]张鹏. 四川泡菜中酵母菌的分离筛选及其应用研究[D]. 哈尔滨:东北农业大学,2007.

[7]中华人民共和国卫生部. GB/T 4789.28-2003 食品卫生微生物学检验 染色法、培养基和试剂[S].

[8]况启生,李安明,戴余军,等. 孝感民间传统米酒菌株的分离、鉴定与筛选、培养[J]. 食品科学,2003,24(9):94-96.

[9]魏景超. 真菌鉴定手册[M]. 上海:上海科技出版社,1997:103-105.

[10]巴尼特,佩恩,亚罗. 酵母菌的特征与鉴定手册[M]. 胡瑞卿译. 青岛:青岛海洋出版社,1991:17-28.

[11]Kurtzman C P,Robnett C J. Identification and phylogeny of ascomycetous yeasts from analysis of nuclear large subunit(26S)ribo so-mal DNA partial sequences[J]. Antonie van Leeuwenhoek,1998,73(4):331-371.

[12]Fell J W,Beokhout T,Fonseca A,et al. Biodiversity and systematics of basidiomycetous yeasts as determined by large-subunit rDNA D1/D2 domain sequence analysis[J]. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology,2000,50(3):1351-1371.

[13]王雪莹.优质甜橙果酒酵母分离、筛选及发酵特性研究[D]. 重庆:西南大学,2013.

[14]杨振泉,高璐,尹永祺,等.不同来源泡菜中乳酸菌的16S-23S rDNA间隔序列扩增及种群多样性分析[J]. 食品工业科技,2012(6):250-252.

[15]张兰威.发酵食品[M]. 哈尔滨:哈尔滨工程大学出版社,1997:132-151.

[16]贺稚非,李洪军. 发酵蔬菜低温贮藏酵母菌动态变化研究[J]. 食品科学,2011(13)：165-168.

[17]曾骏.传统四川泡菜发酵过程中酵母菌的动态变化规律及发酵性能研究[D]. 雅安:四川农业大学,2013.

Separation and identification of yeast during thefermentation of Sichuan pickles

LIU Chun-yan1,DAI Ming-fu2,XIA Jiao1,XU Lin1,SHEN Li-wen1,PU Biao1,*

(1.College of Food,Sichuan Agricultural University,Ya’an 625014,China;2.School of Politics and Public Administration,Zhejiang University of Technology,Hangzhou 310023,China)

A red radish as materials by spontaneous fermentation,old brine fermentation making Sichuan pickle in this paper.The yeast group distribution and dynamic changes during different fermentation period by using the methods of traditional isolation and culture,26S rDNA sequencing technology were studied. The research results showed that,there were 5 kinds of yeast in the fermentation process,which identified asCandidasake,Sporisoriucamicdor,Rhodotorulamucilaginosa,PichiagaleiformsandKazachstaniaexigua. The dynamic results showed thatPichiaspp. andKazachstaniaspp. were the dominant yeast in traditional fermented pickle. In addition,though different species yeast,they had the same dynamic change in two different ways offermentation.

Sichuan pickles;yeast;26S rDNA;dynamic change

2014-04-18

刘春燕(1989-)，女，硕士研究生在读，研究方向；果蔬加工理论与技术。

*通讯作者:蒲彪(1956-)，男，博士，教授，研究方向:果蔬加工、功能性食品。

国家自然科学基金资助项目(31171726)；“十二五”国家科技支撑项目(2012BAD31B04)；四川省科技支撑计划项目(2012NZ0002)。

TS201.3

B

1002-0306(2015)05-0171-04

10.13386/j.issn1002-0306.2015.05.027