枯草杆菌启动子43及amy的转录活性

张婷婷　马磊

摘要：利用报告基因β-半乳糖苷酶，分析了枯草杆菌启动子43及amy的转录活性。结果表明，在基本培养基条件下，启动子43在对数前期开始表现转录活性，随菌量增大活性迅速提高，稳定期逐步平稳；在富营养培养基条件下，启动子43转录活性在对数前期与基本培养基条件下相似，在对数期转录活性增加速率则高于基本培养基条件下的增加速率；启动子43转录活性在E coli和B subtilis体内基本一致。启动子amy在淀粉诱导下转录活性较高，在添加葡萄糖以及无诱导条件下酶活较低。

关键词：枯草杆菌；启动子；转录活性；基因表达

中图分类号： Q933文献标志码： A

文章编号：002-302（204）2-0056-02

启动子是实现外源基因高效表达的关键，是表达载体的核心成分，启动子的转录活性分析是表达载体构建工作的重点之一。在枯草杆菌中常见启动子重叠和串连现象，例如RNA聚合酶σ43（σA）和σ37（σB）的识别区在胞嘧啶脱氨酶基因启动子43序列内重叠[2]。σ43负责营养期的基因起始转录，而σ37负责对数晚期和平台期早期的基因起始转录，因而启动子43可在多个时期起始转录，是理想的发酵工程启动子[3- 4]。本研究应用报告基因β-半乳糖苷酶基因（bgaB），分析启动子43及枯草杆菌α-淀粉酶基因启动子amy的转录活性，为进一步开发高效表达系统奠定基础。

材料和方法

材料

[2]菌株B subtilis A747和E coli DH5α购自中国典型培养物保藏中心；质粒pEB-bgaB为笔者所在实验室构建，该质粒为大肠杆菌-枯草杆菌穿梭载体，携带β-半乳糖苷酶基因（bgaB）。限制性核酸内切酶、碱性磷酸酶、T4 DNA连接酶购自romage公司，Taq DNA聚合酶和LA Taq DNA聚合酶购自宝生物公司，质粒提取、DNA回收试剂盒购自杭州维特洁公司。

2方法

2引物设计根据NCBI数据库中B subtilis基因组上的43和amy序列设计引物，43片段扩增后保留其原有起始密码子（ATG），上下游引物分别为5′-[ZZ（Z]CCGGATCC[ZZ）]TTGTAGAGCTCAGCAT-3′（下划线为BamHⅠ酶切位点）和5′-GG[ZZ（Z]CTGCAG[ZZ）]CATGTGTACATTCCTC-3′（下划线为stⅠ酶切位点）；amy片段扩增后保留了原有信号肽序列，上下游引物分别为5′-AA[ZZ（Z]GGATCC[ZZ）]GCTCATGCCGAGAATAGAC-3′（下划线为BamHⅠ酶切位点）和5′-AT[ZZ（Z]CTGCAG[ZZ）]TTCAGCACTCGCAGCCG-3′（下划线为stⅠ酶切位点）。CR扩增条件：92 ℃变性30 s，60 ℃复性30 s，72 ℃延伸30 s，循环30次。

22[2]载体构建在载体pEB-bgaB上bgaB 5′端的BamHⅠ[2]和stⅠ酶切位点之间，分别插入经回收并酶切的CR产物43和amy，获得质粒pEB-43-bgaB和pEB-amy-bgaB；载体构建成功后，启动子片段43和amy可起始转录bgaB。载体电转入E coli DH5α后，将感受态细胞涂布在含X-gal平板，挑选8 h内出现明显蓝色菌落，提取质粒，酶切鉴定。挑取单菌落摇菌，测定整个生长时期β-半乳糖苷酶活性。

23β-半乳糖苷酶活性测定方法和定义[5]将一定体积菌液离心收集菌体，重悬于700 μL Z-buffer（006 mol/L Na2HO4·7H2O，004 mol/L NaH2O4，00 mol/L KCl，000 mol/L MgSO4·7 H2O和005 mol/L β-巯基乙醇，pH值70），加入0 μL Triton X 00（0%）和溶菌酶0 μL[3]（0 g/L），静止30 min后加入邻硝基苯-β-D-半乳吡喃糖苷（ONG）200 μL（4 g/L），混匀后置于55 ℃水浴5 min，加入[4]Na2CO3 500 μL（ mol/L）终止反应，离心，取上清并测量其D420 nm。

酶活性（U）=[SX（]D420 nm× 000D595 nm×5（min）×V[SX）]（D595 nm为测前菌液吸光度；V为所用菌液的体积，mL）。

2结果与分析

CR扩增获得的43片段大小在250～500 bp之间，amy片段大小在500～750 bp之间（图），与预计大小相符。

在基本培养基（胰蛋白胨%，酵母提取物05%，氯化钠%）条件下，E coli DH5α（pEB-43-bgaB）合成的β-半乳糖苷酶活性在对数前期开始表现，随着菌量增大活性迅速提高，稳定期后逐步平稳，最高可达6 650 U，稳定期后随菌群衰退酶活下降（图2）。在富营养培养基（胰蛋白胨2%，酵母提取物%，氯化钠%）条件下，E coli DH5α（pEB-43-bgaB）[CM（233]合成的 β-半乳糖苷酶活性在对数前期与基本培养基[CM）]

[FK（W2][TZTTtif][FK）]

的结果相似，进入稳定期酶活性增加速率则逐渐超过在基本培养基中速率，最高为9 200 U（图2）。

[FK（W0][TZTT2tif][FK）]

B subtils（pEB-43-bgaB）在富营养培养基条件下，β-半乳糖苷酶活性与E coli DH5α（pEB-amy-bgaB）在在富营养培养基条件下相似，对数前期开始表现，随着菌量增长活性迅速提高，稳定期后逐步平稳，最高可达9 550 U，在稳定期后随着菌群衰退酶活性下降（图3）。

[FK（W0][TZTT3tif][FK）]

E coli DH5α（pEB-amy-bgaB）在添加%可溶性淀粉诱导条件下，β-半乳糖苷酶活性可达 000 U；而在添加%葡萄糖以及无诱导条件下酶活很低，最高只有30 U。B subtils（pEB-amy-bgaB）在无诱导条件下β-半乳糖苷酶活性略高（750 U）。

3讨论

本研究通过检测β-半乳糖苷酶活性，研究了启动子43及amy在B subtils和E coli中的转录活性。本研究发现43转录合成的β-半乳糖苷酶活性，在（pEB-43-bgaB）和（pEB-43-bgaB）中的结果相似，对数前期开始表现，随着菌量增长活性迅速提高，稳定期逐步平稳，同样在稳定期后随着菌群衰退，酶活性下降。在B subtils（pEB-43-bgaB）中β-半乳糖苷酶活性可达9 500 U以上。本研究结果与Ye等在质粒pUB0基础上，以枯草杆菌WB700为宿主菌，利用43启动子和果聚糖蔗糖酶信号肽，在普通培养条件下分泌表达葡萄球菌激酶的结果基本一致[6]。启动子43在E coli中，β-半乳糖苷酶转录的水平可达9 200 U，这可能是由于E coli RNA聚合酶σ70与B subtils σ43具有同源性[6-0]，能够识别结合启动子43，使之在E coli中同样能转录。因而可利用启动子43先在E coli中表达检测外源基因，再转入B subtils中表达。

序列分析比对发现43序列与σ43和σ37的识别序列并不完全保守，σ43和σ37识别序列的保守性显然与启动子的高活性不相符。因而Wang等推测在σ43和σ37识别序列之外还存在其他能够影响启动子活性的因素[8]。在本实验室，另一研究将启动子43的核糖体结合序列删除后，替换上原核典型的核糖体结合序列，发现其转录效率仍然较高，说明影响因素可能不是核糖体结合序列。

本研究发现不同营养条件可影响启动子43的转录活性。对数前期，在基本培养基和富营养条件下启动子43的转录活性差异不大；进入稳定期后，出现差距，43在基本培养基转录表达的β-半乳糖苷酶活性增长逐渐进入了平稳期，而富营养条件下其活性增长率依然很高，持续向上增长。这种差异可能由于启动子43转录效率较高与合成mRNA及蛋白质原料有限之间的矛盾引起。对数前期及对数期，菌量小，营养充足，差异不明显，进入稳定期后，随着菌群扩大及启动子43高效率转录，营养矛盾造成的差异逐步突出，因而优化营养条件有助于提高启动子43的转录活性。

启动子amy在E coli中转录活性较低，β-半乳糖苷酶活性在诱导条件下最高为 000 U。活性弱的原因可能是虽然启动子amy也是由B subtils RNA聚合酶σ43识别转录，但对E coli的σ70因子亲和性低，因而在E coli中转录水平低；另一原因也可能是携带α-淀粉酶的信号肽的β-半乳糖苷酶融合元，在E coli胞内未能切除信号肽，以无活性的蛋白形式存在。启动子amy在B subtils中转录活性本身可能就不太高，Gat以绿色荧光蛋白为报告基因，利用B subtils WB600和pUB0衍生载体，发现amy活性较低。因此amy的序列还有待改造提高其活性。

[HS2][HT85H]参考文献：[HT8SS]

[ZK（#]徐友强，马翠卿，陶飞，等 细菌启动子识别及应用研究进展 生物工程学报，200，26（0）：393-403

[2]Wang Z，Doi R H Overlapping promoters transcribed by Bacillus subtilis sigma 55 and sigma 37 RNA polymerase holoenzymes during growth and stationary phases ournal of Biological Chemistry，984，259（3）：869-8625

[3]Blombach B， Eikmanns B Current knowledge on isobutanol production with Escherichia coli，Bacillus subtilis and Corynebacterium glutamicum Bioengineered，20，2（6）：346-350

[4]Lu Y ，Lin Q，Wang ，et al Overexpression and characterization in Bacillus subtilis of a positionally nonspecific lipase from roteus vulgaris ournal of Industrial Microbiology & Biotechnology，200，37（9）：99-925