枯草芽孢杆菌OKB05菌株不同培养基发酵上清液的杀线活性

夏彦飞 +郑伟 苏盼盼 乔俊卿 王建华 黄晓博

摘要：采用室内离体测定方法，测试枯草芽孢杆菌OKB05菌株在不同培养基（Landy、LB、λ肉汤、TY、超级肉汤、胰化蛋白胨肉汤、TYGN、A、M63、M9）的发酵滤液中对植物寄生线虫[南方根结线虫（Meloidogyne incognita） 2龄幼虫、程氏伞滑刃线虫（Bursaphelenchus chengi）、豆伞滑刃线虫（B doui）、拟松材线虫（B mucronatus）]的生物活性，以期获得具有较高防效的发酵培养基。结果表明：OKB05菌株的培养滤液分别处理植物寄生线虫6 h后，对南方根结线虫2龄幼虫防效较佳的发酵培养基是TYGN、LB、LANDY、TY、胰化蛋白胨肉汤、超级肉汤等6个培养基；对豆伞滑刃线虫防效较佳的是TYGN和TY 等2个培养基；对豆伞滑刃线虫、拟松材线虫防效最佳的是TYGN培养基；OKB05菌株TYGN培养基发酵上清液对4种标靶线虫都具有较强的拮抗性。

关键词：枯草芽孢杆菌；植物寄生线虫；培养基；发酵滤液；杀线活性；拮抗性

中图分类号： S43245文献标志码： A

文章编号：002-302（204）2-044-04

物防治研究。Tel：（0379）64282345；E-mail：xyfwcc@63com。

[ZK）]

植物寄生线虫分布广，寄主多，是危害农作物的主要病原生物之一，每年给主要农作物造成的损失高达 250亿美元，同时它能使真菌和细菌易侵染植物，也是诱发植物病害的重要原因之一。化学防治植物寄生线虫具有防效好、见效快的特点，但是不可避免地污染了自然环境，因此生物防治越来越受到广泛的关注[2]。利用细菌生防植物寄生线虫是当今新的研究热点，各种各样的细菌从寄主植物、线虫体、线虫的卵、土壤中被分离，其不同的作用方式已被报道[3-7]。芽孢杆菌（Bacillus spp）能够产生耐热、耐旱、抗紫外线和有机溶剂的内生孢子，是理想的生防菌筛选对象[8]。关于芽孢杆菌防治线虫的研究，国内外已有大量的报道[9-5]。本研究通过室内离体试验对枯草芽孢杆菌（B subtilis）OKB05菌株在不同培养基上的发酵上清液对4种植物寄生线虫[南方根结线虫（Meloidogyne incognita）、拟松材线虫（Bursaphelenchus mucronatus）、豆伞滑刃线虫（B doui）、程氏伞滑刃线虫（B chengi）]的防效进行评估。

材料与方法

供试菌种和线虫

枯草芽孢杆菌OKB05菌株、南方根结线虫、拟松材线虫、豆伞刃线虫、程氏伞滑刃线虫，均保存于笔者所在实验室。

2培养基

本研究中所用的培养基为DA、Landy、LB、λ肉汤、TY、超级肉汤、胰化蛋白胨肉汤、TYGN、A、M63、M9。DA和Landy的配制分别参考文献[6-7]，其余培养基的配制参考文献[8]。

3供试线虫的培养和分离

拟松材线虫、豆伞滑刃线虫、程氏伞滑刃线虫接种在灰葡萄孢（Botrytis cinerea）上，25 ℃恒温培养箱中分别培养7～ 20 d，转移到4 ℃冰箱备用。南方根结线虫的卵块接种在感病番茄上，放置于温室中培养50 d左右，然后从番茄根部挑取卵块，卵块用3% H2O2表面消毒8 min，再用ddH2O清洗3次后置于4 ℃冰箱中备用。采用贝曼漏斗法分离4种培养好的线虫。收集好的线虫先用3% H2O2表面消毒 5 min，然后再用ddH2O清洗3次，此时得到的线虫即为试验所用线虫。

4杀线物质的制备

将甘油保存的OKB05菌株在LB平板上划线，37 ℃过夜活化培养；用灭菌牙签挑取单菌落于LB液体中培养过夜，37 ℃，200 r/min；第2天按3%的接种量吸取6 mL过夜培养的菌液，分别接种至200 mL 的Landy、LB、TY、超级肉汤、胰化蛋白胨肉汤、TYGN、A、M63、M9、λ肉汤等0种培养基中，37 ℃，200 r/min培养48 h。培养结束后，4 ℃ 0 000 r/min离心5 min，收集上清液。

5室内离体试验

吸取发酵后的培养滤液原液2 mL至直径为6 cm的灭菌表面皿中，挑入50头表面消过毒的线虫，再将该表面皿置于灭过菌的医用铝盒中，放置于25 ℃恒温培养箱中，以ddH2O、没有接种细菌的培养基作对照，分别在6、2、24、36 h观察线虫的死亡情况。在解剖镜下观察并记录线虫的死亡数量，线虫用挑针触碰，如果不动，则认定线虫死亡[9]。

6数据处理

所得数据用SSS统计软件进行方差分析。

2结果与分析

2OKB05菌株在不同培养基上的发酵上清液对南方根结线虫杀线活性的测定

表表明，处理后6 h，TYGN、LB、LANDY、TY、胰化蛋白胨肉汤、超级肉汤、λ肉汤等7个培养基的发酵滤液的杀线率与M63、M9、A以及对照差异显著；TYGN、LB、LANDY、TY、胰化蛋白胨肉汤、超级肉汤等6个培养基发酵上清液的杀线率都达到了98%以上，与λ肉汤培养基的杀线率（8392%）差异显著。随着处理时间的延长，2 h后TYGN、LB、LANDY、TY、胰化蛋白胨肉汤、超级肉汤、λ肉汤等7个培养基的处理杀线率都达到了00%，与A、M9、M63及对照差异显著。因此，在后续的研究中仅选择TYGN、LB、LANDY、TY、胰化蛋白胨肉汤和λ肉汤6种培养基对OKB05菌株进行发酵培养，验证其发酵上清液对其他植物寄生线虫的杀线率。[FL）]

[FK（W5][HT6H][Z][WTHZ]表OKB05菌株不同培养基发酵上清液对南方根结线虫杀线率的影响[WTBZ][HTSS][STBZ]

[H5][BG（！][BHDFG3，WK2，WK48W]培养基[ZB（][BHDWG2，WK48W]杀线率（%）endprint

[BHDWG2，WK2。4W]6 h2 h24 h36 h[ZB）W]

[BHDG2，WK2ZQ2，WK2。4W]TYGN0000±000a0000±000a0000±000a0000±000a

[BHDW]LB0000±000a0000±000a0000±000a0000±000a

[BH]LANDY0000±000a0000±000a0000±000a0000±000a

[BH]TY987±28a0000±000a0000±000a0000±000a

[BH]胰化蛋白胨肉汤9856±50a0000±000a0000±000a0000±000a

[BH]超级肉汤9857±33a0000±000a0000±000a0000±000a

[BH]λ肉汤8392±054b0000±000a0000±000a0000±000a

[BH]A056±096c26±046b705±33b95±2b

[BH]M9056±096c2±7b467±53c62±33c

[BH]M63000±000c6±086b342±052d60±258c

[BH]ddH2O2（CK）000±000c000±000c000±000f000±000d

[BH]空白（CK2）000±000c000±000c000±000f000±000d[H][BG）F]

注：同列数据后不同字母表示差异显著（<005）。[FK）]

[FL（2K2]22OKB05菌株在6种不同培养基上的发酵上清液对拟松材线虫、豆伞滑刃线虫、程氏伞滑刃线虫杀线活性的测定

表2显示，用OKB05菌株在6种培养基上的发酵上清液分别处理程氏伞滑刃线虫6 h 后，TYGN和TY等 2个培养基处理防效最佳，杀线率达00%，与其他4种培养基处理差异显著；其次是超级肉汤培养基处理，杀线率为905%，防效较差的是胰化蛋白胨肉汤、LANDY培养基，杀线率分别为658%、5900%，两者之间差异不显著。处理2 h后，超级肉汤、LB等2个培养基的杀线率也都达到了00%，TYGN、TY 、超级肉汤、LB 等4个培养基差异不显著，与胰化蛋白胨肉汤、LANDY 培养基差异显著。至36 h，LANDY培养基与其他5个培养基之间仍然差异显著。在所有的处理时间段，各个培养基都与对照差异显著。可见用OKB05菌株在TYGN和TY 等2个培养基的发酵滤液处理程氏伞滑刃线虫的防效最佳，6 h后线虫的死亡率就达到了00%。

用TYGN、LB、TY、LANDY、超级肉汤、胰化蛋白胨肉汤等6个培养基的培养滤液分别处理豆伞滑刃线虫6 h后，线虫的死亡率分别为8542%、5582%、3857%、3385%、242%、52%，6个培养基中除了TY和LANDY 等2个培养基之间差异不显著外，其余培养基之间差异显著（表2）。随着处理时间的延长，各处理的线虫死亡率增加，其显著性差异也出现变化，处理2 h后杀线率最高的是TYGN培养滤液，为9248%，与其余5个培养基差异显著；处理24 h后，TYGN、TY、胰化蛋白胨肉汤的培养滤液之间差异不显著，杀线率分别为00%、00%、9733%，但与其他3个培养基之间差异显著；处理36 h后，6个培养基的杀线率都达到了92% 以上，其中LANDY、超级肉汤2个培养基之间差异不显著，但与其余4个培养基之间差异显著，这4个培养基之间差异不显著。在所有的处理时间段，各个培养基都与对照差异显著。综合比较结果表明，对豆伞滑刃线虫具有最佳防效的发酵培养基是TYGN培养基。

表2还显示，对拟松材线虫处理6 h后，防效最佳的发酵培养基是TYGN培养基，杀线率为604%，与其他培养滤液之间差异显著。TYGN培养基的线虫在处理2、24 h后，线虫死亡率分别为9575%、00%，在相同的时间段与其余培养基进行比较同样发现差异显著。处理36 h后，LB、超级肉汤、胰化蛋白胨肉汤、TY等4个培养滤液的杀线率也达到了00%，LANDY培养基处理的杀线率为820%，与其他5个培养基差异显著。在4个处理时间段中除了在6 h，超级肉汤、胰化蛋白胨肉汤、TY等3个培养基与对照差异不显著之外，其他的各个培养基都与对照差异显著。结果表明，拮抗拟松材线虫的最佳发酵培养基是TYGN培养基。

南方根结线虫和程氏伞滑刃线虫对OKB05菌株的发酵上清液较敏感，处理6 h后杀线率均为00%，豆伞滑刃线虫为8542%、拟松材线虫为604%，OKB05菌株在TYGN培养基上的发酵上清液对南方根结线虫和程氏伞滑刃线虫杀线率差异不显著，其余差异显著；处理后24 h，4种线虫的死亡率都达到了00%，且差异不显著。在不同的处理时间内，OKB05菌株的处理与对照差异显著。结果表明[CM（25]：OKB05菌株TYGN培养基发酵滤液处理对4种植物寄[CM）]

3结论与讨论

植物根围促生细菌（plant growth-promoting rhizobacteria，GR）不仅可以促进植物的生长，还可以防治根结线虫病、青枯病、疫病和黄萎病等，成为近几年兴起的新的研究热点[20-23]。芽孢杆菌属是GR中极具应用潜力的线虫生防资源，其防治线虫病的研究也取得了很大的进展[24-26]。本研究结果表明，OKB05菌株在0种不同培养基滤液中都对南方根结线虫2龄幼虫有一定的拮抗作用，但是防效有差异，其中TYGN、LB、LANDY、TY、胰化蛋白胨肉汤、超级肉汤6个培养基发酵上清液的处理防效较佳，处理2 h后杀线率达到了00%，出现该现象可能是因为在不同的培养基进行发酵，OKB05菌株产生的杀线虫活性物质成分不同，或者活性物质的含量有差异造成的。

TYGN、LB、LANDY、TY、胰化蛋白胨肉汤、超级肉汤6个培养基发酵滤液进一步来处理程氏伞滑刃线虫、豆伞滑刃线虫、拟松材线虫 3种植物寄生线虫，结果表明，3种植物寄生线虫对6种OKB05菌株的培养滤液敏感程度不一致，其中在处理程氏伞滑刃线虫、豆伞滑刃线虫、拟松材线虫6 h后的最佳防效培养基分别是TYGN和TY、TYGN、TYGN，其杀线率分别为00%、8542%、604%，当然随着处理时间的延长，杀线率也逐渐增加，其处理之间的差异性也会出现相应的变化。本研究结果进一步证实了前面的推测。OKB05菌株在TYGN培养基上的发酵上清液对4种标靶线虫都表现了较佳的防治效果，但拮抗能力有差异，出现这种现象可能是由于不同种的线虫在抗逆性、敏感性、寄生方式以及虫体的结构等方面的差异造成的。endprint

本研究为以后生防细菌的筛选以及如何选择合适的培养基提供了理论基础，并为下一步对枯草芽孢杆菌OKB05菌株生防制剂的开发和利用以及杀线活性物质的分离、鉴定、结构分析奠定了基础。

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