纳米复合材料标记物放大电化学免疫分析乳制品中的大肠杆菌

张新爱 郑光荣 申建忠 韩恩 董晓娅

摘要：将检测抗体（dAb和二茂铁甲酸（FCA固载于二氧化硅修饰的氧化锌（nO@SiO2表面制备纳米复合材料标记物（{dAb-nO-FCA}，并将其用于放大电化学免疫分析乳制品中大肠杆菌（Escherichia coli。采用“三明治”免疫分析模式，基于二茂铁甲酸产生的电流信号与大肠杆菌浓度之间的关系实现了对大肠杆菌的检测。结果表明，二茂铁甲酸产生的电流信号与大肠杆菌浓度的对数在20×102 ～ 20×106 CFU/mL范围内保持良好的线性关系，检出限为100 CFU/mL（S/N=3。利用该电化学免疫分析方法对乳制品进行了大肠杆菌的加标回收试验，回收率在958%～105%之间。

关键词：纳米复合材料标记物；放大电化学免疫分析；乳制品；大肠杆菌

中图分类号： TS2074文献标志码： A

文章编号：1002-1302（201412-0342-02[HS][HT9SS]

收稿日期：2014-07-14

基金项目：国家自然科学基金（ 编号：21205051；中国博士后科学基金（ 编号：2013M541605；江苏大学高级专业人才科研启动基金（编号：11JDG144。

作者简介：张新爱（1982—，女，博士，讲师，从事食品质量与安全研究。 E-mail：zhangxinai@mailujseducn。

乳制品含有丰富的营养物质，在生产、加工、运输和储存过程中极易受到致病性细菌的污染，从而会影响人们的生活质量和健康水平[1]。人类通过乳源性途径引起的食物中毒与乳制品中大肠杆菌（Escherichia coli的数量呈现一定的相关性，因此，大肠杆菌已经成为评价乳制品卫生质量的重要指标，被世界各国乳制品微生物标准列为必检项目。目前，大肠杆菌常用的检测方法，由于耗时长在一定程度上已经不能满足快速检测的需求。因此，建立乳制品中大肠杆菌的快速、灵敏、准确的检测方法显得尤为重要。

免疫检测技术由于具有选择性好、抗干扰能力强的特点而得到了人们的普遍关注[3-5]。其中，电化学免疫分析法具有简单快速、选择性好、易于小型化等优点[6]。实现信号放大从而提高检测灵敏度是制约电化学免疫分析方法快速发展的关键问题[7]。纳米材料的应用为发展新型灵敏的电化学免疫分析体系打开了一片新天地[8-9]。纳米复合材料突破了单一组分材料性能的局限，具有体积小、比表面积大等特点，因而被广泛用于制备纳米复合材料标记物进而提高电化学分析技术的灵敏度[10]。

采用二氧化硅修饰的氧化锌（nO@SiO2固载检测抗体（dAb和二茂铁甲酸（FCA制备纳米复合材料标记物 （{dAb-nO-FCA}，并将其用于放大电化学免疫分析乳制品中大肠杆菌。基于大肠杆菌与其抗体之间的特异性相互作用构建“三明治”免疫分析模式，采用示差脉冲伏安法测定结合在电极表面的二茂铁甲酸获得电流信号。

1材料与方法

11仪器及试剂

二茂铁甲酸（FCA、牛血清白蛋白（BSA、1-（3-二甲氨基丙基-3-乙基碳二亚胺盐（EDC、N-羟基琥珀酰亚胺（NHS购于Sigma公司；3-氨基丙基三乙氧基硅烷（APTES、正硅酸乙酯（TEOS由阿拉丁试剂公司（中国上海提供。半胱氨酸（L-cysteine购于上海晶纯实业有限公司。试验所用其他试剂均购于上海国药集团化学试剂有限公司。

12{dAb-nO-FCA}的制备

121制备氧化锌纳米棒在搅拌条件下，将60 mL氢氧化钠溶液（10 mol/L逐滴加到100 mL硝酸锌溶液（004 mol/L中。随着氢氧化钠的加入，有白色沉淀生成，继续滴加，沉淀溶解。室温搅拌2 h后，加热至沸腾并回流1 h。趁热用045 μm的微孔玻璃漏斗过滤，将所得白色沉淀置于空气中晾干至恒重。

122制备二氧化硅修饰的氧化锌纳米棒将20 mg氧化锌纳米棒分散于20 mL丙醇和40 mL乙醇的混合液中并超声10 min。在搅拌条件下，依次加入15 mL氨水溶液（25%、320 μL TEOS和80 μL APTES，室温下反应8 h。将上述溶液在8 000 r/min，离心10 min制得nO@SiO2，随后用去超纯水清洗该沉淀并将其分散于20 mL磷酸缓冲溶液（PBS中。

123制备{dAb-nO-FCA}取10 mL nO@SiO2溶液，依次向其中加入10 mL 040 mol/L EDC-010 mol/L NHS混合液、40 mg/mL检测抗体（dAb和10 mL二茂铁甲酸饱和溶液，在37 ℃搅拌2 h。经离心分离并洗涤后，将制得的{dAb-nO-FCA}用PBS分散并置于冰箱中4 ℃保存。

13免疫传感器的制备

金电极（Ф=3 mm修饰前需进行预处理：首先依次用030、005 μm的Al2O3粉末在金相砂纸上打磨抛光，再依次用乙醇、水超声清洗，最后置于050 mol/L硫酸溶液中在 -030～15 V 电位范围内进行循环伏安扫描，直至得到稳定的循环伏安图。把预处理过的金电极浸入002 mol/L半胱氨酸的乙酸缓冲溶液（pH 值50中自组装6 h。取出电极用水清洗后，置于040 mol/L EDC-010 mol/L NHS的溶液中反应1 h用于活化电极末端的羧基，然后用PBS清洗电极表面并用氮气吹干。将10 μL捕获抗体（cAb溶液（10 mg/mL滴涂在金电极表面并在37 ℃下培养1 h后，用PBS清洗电极以除去未结合的抗体并晾干。在电极表面滴加10% BSA-PBS溶液并培养30 min以封闭活性位点。

2结果与分析

21免疫测定条件的优化

温度对免疫蛋白分子的活性有一定的影响，本试验研究了在20 ～ 45 ℃范围内对电化学免疫分析方法检测大肠杆菌的影响。响应电流随反应温度的升高而逐渐增大，说明大肠杆菌和其抗体结合的速度随着温度的增加而提高。在35 ℃时，免疫反应最充分，电流响应最大。当温度继续上升，响应电流逐步下降，表明过高的反应温度使少数免疫分子变性或失活，导致修饰电极表面的大肠杆菌和其抗体部分脱落，因此选择35 ℃为最佳免疫反应温度。

抗体与抗原发生免疫反应与时间有关。本研究考察了免疫时间在20 ～ 70 min范围内对电化学免疫分析方法检测大肠杆菌的影响。结果表明，响应电流随着免疫反应时间的增加而增强，在50 min时，响应电流趋于稳定，因此选择50 min为最佳免疫反应时间。

22免疫测定的工作曲线

电化学免疫分析方法用于大肠杆菌检测的原理，首先将捕获抗体固定在半胱氨酸修饰的金电极表面，然后免疫结合大肠杆菌，进而吸附{dAb-nO-FCA}构建“三明治”免疫分析模式，最后用示差脉冲伏安法测定电极表面的二茂铁甲酸获得电流信号。随着待测溶液中大肠杆菌浓度的增大，固定在电极表面的{dAb-nO-FCA}就越多，因此产生的电流信号就越强。

[JP2]在优化的试验条件下，将该分析方法用于检测不同浓度的大肠杆菌标准溶液。二茂铁甲酸产生的响应电流随着待测大肠杆菌浓度对数的线性关系见图1。结果表明，二茂铁甲酸产生的响应电流与大肠杆菌浓度的对数在20×102～20×106 CFU/mL的浓度范围内呈线性关系，线性回归方程为I=[JP2]152×lgC-077，r=0984，检出限为100 CFU/mL（S/N=3。

[F（W11][TPXA1tif][F]

23回收率试验

为了进一步研究电化学免疫分析方法的实用性，本研究采用该方法对乳制品进行了大肠杆菌加标回收检测。选择加标浓度分别为50×102、10×103、10×104 CFU/mL，测定结果见表1，该免疫分析方法与平板计数法的相对误差在±8%以内，计算得到其回收率为958%～1050%，表明该电化学免疫分析方法用于乳制品中大肠杆菌检测具有可靠性好、准确度高等优点。

[F（W7][HT6H][J]表1乳制品加标回收率测定[HTSS][STB]

[HJ5][BG（！][BHDFG3，W5，W18，W6W]样品[B（][BHDWG12，W18W]加标回收量（CFU/mL[BHDWG12，W6。3W][XXSX2-SX172]检出量加入量测出量[BW]回收率（%

[BHDG12，W5，W6。4W]酸奶未检出50×102479958

[BHDW]婴儿奶粉未检出10×1031 0501050

纯奶未检出10×1049 720972[HJ][BG）F][F）]

3结论

采用nO@SiO2作为载体固定检测抗体和二茂铁甲酸制备了金纳米棒标记物，并将其用于电化学免疫分析乳制品中大肠杆菌。nO@SiO2具有生物相容性好、比表面积大的优点，能够固载大量二茂铁甲酸，从而放大电流信号提高大肠杆菌检测的灵敏度。将该电化学免疫分析方法应用于乳制品的加标回收试验，结果令人满意。

[HS2][HT85H]参考文献：[HT8SS]

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