魟鱼软骨多糖滴眼液在家兔眼内的药代动力学研究

李明月，郭 斌，曹见敏

1辽宁医学院，辽宁锦州 121000；2辽宁医学院附属第一医院，辽宁锦州 121000

郭斌等[1]首次从魟鱼软骨中得到两个单一糖胺聚糖RCGⅠ和RCGⅡ。魟鱼软骨多糖(Ray cartilage glycosaminoglycans，RCG)具有抗肿瘤、可抑制鸡胚绒毛尿囊膜血管生长、增强免疫力的作用[2]；体外试验表明，RCG可抑制胶原酶对胶原蛋白的水解[3]、抑制内皮细胞的增殖、防治角膜新生血管[4]。其滴眼液为角膜新生血管等病症提供了新的解决方案[5]。本实验通过紫外-可见光分光光度计检测家兔眼部使用魟鱼软骨多糖滴眼液后角膜、虹膜、玻璃体及房水的药物浓度，并进一步对兔眼内药物的药代动力学进行研究，在今后的临床用药等方面具有一定的应用价值。

材料和方法

1 试剂与仪器 魟鱼软骨多糖(锦州海洋药业研究开发中心研制，纯度99.9%，批号：080901)，魟鱼软骨多糖滴眼液(辽宁医学院附属第一医院制剂室制备，浓度为50.03 mg/ml，批号：080301)葡萄糖醛酸标准品(Alfa公司，批号：L2271112)0.9%氯化钠注射液(华仁药业股份有限公司，批号：Q1309019)，20%乌拉坦溶液，由辽宁医学院药理教研室提供。UV 255紫外-可见分光光度计(日本岛津)，FC 204型电子分析天平(上海市精科天平)，旋混合器(碧云天生物技术研究所)。

2 实验动物 健康家兔20只(辽宁医学院实验动物中心提供，合格证lnyxy20140507)，体质量2.2 ～2.7 kg，雌雄各半。实验前1 d，将家兔左右眼分别进行简单的眼部检查，检查指标包括是否有眼睛刺激性症状，观察兔眼内结膜颜色及是否有损伤、不完整等，如有以上情况排除。

3 给药及样品采集 将家兔随机分成10组，每组2只，用拇指和示指将家兔眼睑捏拉成漏斗状，用中指压住鼻泪管在家兔左右两眼内分别使用微量取样器滴入魟鱼软骨多糖滴眼液200μl，滴入药后轻揉眼睑15 s。滴眼后于10 min、20 min、30 min、60 min、90 min、120 min、180 min、240 min、300 min、360 min耳缘静脉空气栓塞处死家兔，用10 ml的0.9%氯化钠注射液冲洗兔眼，用纸吸干眼表水分，在角膜缘处吸取房水，迅速取出眼球，固定眼球位置后用灭菌注射器在角膜后缘2 ～3 mm处刺进玻璃体腔，收集胶黏胶液体状的玻璃体，再分离出角膜、虹膜，每个时间点取4只眼，准确称重后将所有样品置于-20℃冰箱中冷冻保存[6-8]。4 兔眼房水及玻璃体处理 分别取含药房水200μl和玻璃体200μl于EP管中并加入500μl饱和硼酸溶液，涡旋震荡1 min充分混合，沉淀蛋白质及杂质，以10 000 r/min离心15 min，精确量取上清液200μl待测，计算兔眼房水及玻璃体中魟鱼软骨多糖的药物浓度。

5 兔眼固体样本处理 将兔角膜与虹膜，分别剪成约1 mm3小块后分别倒入匀浆器中充分匀浆后，分别取200μl，并于EP管中与500μl饱和硼酸溶液混合后涡旋震荡5 min，在10 000 r/min条件下离心20 min后精确取出上清液200μl，用来测定兔眼角膜与虹膜中魟鱼软骨多糖的药物浓度。

6 兔眼内各组织浓度的测定 1)对照品储备液的制备：分别精确称量0.099 1 g、0.107 4 g、0.101 5 g、 0.100 3 g烘干恒重后的葡萄糖醛酸，分别置于50 ml容量瓶中，加入饱和的硼酸溶液使溶解定容至刻度并摇匀，并在该容量瓶中量取2 ml溶液，与饱和的硼酸溶液在另一50 ml容量瓶混匀定容至刻度，摇匀，再精确称量0.2 ml溶液分别加至0.2 ml已去好蛋白的空白角膜、虹膜、玻璃体及房水溶液中，涡旋1 ～ 2 min并摇至均匀，所得40.12 μg/ ml、42.96 μg/ml、40.60 μg/ml、39.62 μg/ml分别为含葡萄糖的角膜样品、虹膜样品、玻璃体样品以及含葡萄糖房水样品，作为对照品储备液。2)样品溶液的制备：将处理后的兔眼角膜、虹膜、玻璃体以及房水的0.1 ml溶液加至10 ml具塞试管放置在冰盐浴中，使其冷却，缓慢滴加四硼酸钠硫酸溶液5.0 ml，期间不停地用玻璃棒搅拌，搅拌均匀后保持瓶塞密闭，在水浴锅内以90℃加热20 min，迅速冷却后，加0.2%咔唑乙醇溶液0.2 ml并混匀，处理后的混合溶液放在沸水浴中，并在加热20 min后将其冷却至室温。将经过以上处理后的样品置于波长为529 nm处采用紫外-可见光分光光度法分别测定角膜、虹膜、玻璃体及房水中样品的吸收度A值[9]。3)标准曲线和线性范围：配制浓度为1 μg/ml、2 μg/ml、3 μg/ml、4 μg/ ml、5 μg/ml的葡萄糖醛酸(房水或玻璃体)溶液于10 ml具塞试管中，另配制葡萄糖醛酸角膜溶液的浓度为1.5 μg/ml、7.5 μg/ml、15 μg/ml、20 μg/ml、30 μg/ml，葡萄糖醛酸虹膜溶液的浓度为0.5 μg/ml、5 μg/ml、10 μg/ml、15 μg/ml、20 μg/ml，后续方法同上述操作测定样品吸光度A值，绘制标准曲线并确定线性范围。4)精密度实验：配置不同浓度的含药房水、玻璃体、角膜、虹膜溶液，每个样品浓度重复测定5次得到日内精密度，-20℃冰箱内将样品密封保存以待测定日间精密度，每个样品连续5 d进行重复测定，所有样品测定3次即得到日间精密度。5)加样回收率实验：精密称取已知准确浓度的魟鱼软骨多糖加至去蛋白角膜、虹膜、玻璃体及已去蛋白的房水试液中，后续方法同上述操作测定吸收度A值。回收率=检出量/加入量。

结 果

1 魟鱼软骨多糖在角膜，虹膜，玻璃体及房水中的浓度变化 家兔在不同时间点给药后，兔眼内角膜、虹膜、玻璃体及房水中的药物浓度见表1，以时间为横坐标，药物在兔眼内的浓度为纵坐标，通过软件绘制出魟鱼多糖滴眼液在兔眼内角膜、虹膜、玻璃体及房水中代谢的药物浓度-时间曲线(图1)并拟和出药代动力学参数(表2)，符合二室模型。

2 标准曲线和线性范围 以葡萄糖醛酸浓度为横坐标，以其相应的吸收度为纵坐标，绘制标准曲线，经回归处理，其回归方程（角膜、虹膜、玻璃体、房水）分别为Y= 0.029 1x+0.349 3，r2=0.999 5、Y=0.036x+0.223 71，r2=0.999 2、Y=0.033x+0.284 4，r2=0.999 1、Y=0.039 6x+0.253 7，r2=0.999 6。结果表明，兔眼角膜、虹膜、玻璃体及房水中葡萄糖醛酸分别在1.5 ～ 30 μg/ml、0.5 ～ 20 μg/ml、1.0 ～5.0 μg/ml、0.5 ～ 1.5 μg/ml范围内线性关系良好，结果见表3。

3 精密度实验 《中国药典》(2010版)规定，日内精密度与日间精密度＜5%，魟鱼软骨多糖在角膜、虹膜、玻璃体及房水中的平均日内精密度分别是1.73%、1.46%、1.46%、1.28%，平均日间精密度分别是1.57%、2.16%、1.60%、2.16% 。结果见表4、表5。

图1 魟鱼软骨多糖滴入眼内后在兔眼中的药物浓度-时间曲线Fig. 1 Concentrations of RGC eye drops in rabbit eyes

表1 魟鱼软骨多糖滴眼液滴眼后角膜、虹膜、玻璃体及房水中药物浓度变化Tab. 1 Drug concentration in cornea, iris, vitreous and aqueous humor after RCG eye drops

4 方法回收率试验 《中国药典》(2010版)规定回收率＞90%，RSD值＜5%，魟鱼软骨多糖在角膜、虹膜、玻璃体及房水中的平均回收率分别是97.93%、96.4%、96.3%、96.98%。结果见表6、表7。

讨 论

魟鱼软骨多糖是魟鱼软骨经盐酸胍提取，膜超滤、丙酮分级沉淀、三氯乙酸沉淀、Sephadex凝胶柱层析分离纯化获得的，分子量为9.7×104，纯度为99%以上。目前，我国在魟鱼生理活性物质的研究和分离提取抗肿瘤活性成分方面已经取得了一定成就[10]，国内一些文献也研究魟鱼软骨多糖滴眼液抗角膜新生血管的形成[11]；国外在抗肿瘤方面进行了探索，1983年，Lee和Langer[12]首先发表鲨鱼软骨含抗肿瘤血管增生成分的相关研究，其他成分也有所研究[13]，但是魟鱼软骨多糖滴眼液在眼部，包括角膜、虹膜、玻璃体、房水中的药代动力学目前国内外还没有相关研究。笔者以此为基础通过紫外-可见分光光度计法，对给予魟鱼软骨多糖滴眼液后家兔的兔眼内角膜、虹膜、玻璃体及房水在不同时间点的魟鱼软骨多糖药物浓度进行测定，并进一步对家兔兔眼内药代动力学进行研究。由于紫外可见分光光度计在时间上的耗费远远低于高效液相色谱仪，突出性地缩短了时间、降低了实验成本并增加了效率，避免了实验中带来的误差和失误。选择家兔为眼用制剂研究对象主要因为兔和人眼结构特点相似[14]，而在实验中角膜、虹膜、房水及玻璃体可以相对准确地反映兔眼内药物浓度的变化，且比较准确，减少了实验的误差[15-17]。本实验基于魟鱼软骨多糖具有显著抗角膜新生血管形成作用的论点并在剂型上选择使用滴眼液制剂，不仅可以延长药效，还可以提高药物的生物利用度。1990年，Takigawa等从人克隆软骨细胞株HCS-2/8细胞获得了一种多肽因子，此因子能对抗血管新生，还具有抗肿瘤的活性。本实验选择作为海洋生物的魟鱼，其软骨多糖在临床应用上应用广泛，并为今后的临床研究以及魟鱼软骨多糖眼用纳米乳的药代动力学及药效学的研究提供了参考。

为使实验结果更加具说服性，笔者选用了眼内不同部分的药代动力学进行分析，采用紫外-可见分光光度计对空白组织液中的标准品进行方法学的研究分析，以保证实验的精确性及稳定性。在实验组中，滴眼液滴眼后，角膜内在9.81 min左右达到最高浓度29.03±0.38μg/L，而后在58.53 min开始依次到达虹膜、房水、玻璃体，并

且其最高浓度也依次下降，说明滴眼液点眼后的瞬间，药物渗透到角膜内发挥作用，药物逐渐与角膜混合，即向角膜转运，进而逐步到达虹膜，保证了药物的平衡。实验表明，虹膜中的药物于58.53±0.54 min达到峰浓度，为16.83±0.12μg/L。随时间进行10 min后，可看到角膜中的药物浓度下降的过程，吸收入角膜的药物转运如房水，房水中的药物又通过房水循环从而排出，这是药物吸收和药物消除的过程。由于房水是充满了眼前房和后房的一种循环液体，浸浴着周边组织，通过它将药物转运到玻璃体，以致药物最终达玻璃体内的含量极少，导致药物在玻璃体内的浓度非常低，且波动不大，峰浓度仅为1.51±0.43μg/L。由于药物最终达玻璃体内的含量有限，导致药物在玻璃体内的浓度非常低。通过实验表明，在临床上如需使用魟鱼软骨多糖滴眼液治疗玻璃体内病症，可考虑通过玻璃体腔内注射或提高药物用量来增加玻璃体内的浓度，进而提高药物的药效。若使药物渗透到后面组织部位，研究者也可以在眼用剂型上有所改变，例如魟鱼软骨多糖眼用纳米乳的纳米乳剂型，也可以在滴眼液中添加少许增加渗透度的添加剂[18]，但国内外至今在魟鱼软骨多糖滴眼液方面的研究非常少，还需要一些新型的材料剂型在眼科滴眼液中的应用更广泛以便今后研究[19-21]。

表2 兔眼滴入魟鱼软骨多糖滴眼液100μl后在角膜、虹膜、房水及玻璃体中的药代动力学参数Tab. 2 Pharmacokinetic parameters of RGC eye drops in cornea, iris, aqueous humor and vitreous after ocular administration of 100μl eye drops

表3 葡萄糖醛酸浓度各点的吸收度Tab. 3 Absorption value (A) of glucuronide concentration in each standard

表4 魟鱼软骨多糖在角膜与虹膜中的精密度Tab. 4 Precision of RCG in cornea and iris

表5 魟鱼软骨多糖在玻璃体与房水中精密度Tab. 5 Precision of RCG in vitreous and aqueous humor

表6 魟鱼软骨多糖在角膜与虹膜中的回收率Tab. 6 Recovery rate of RCG in cornea and iris (-x±s, n=5)

表7 魟鱼软骨多糖在玻璃体与房水的回收率Tab. 7 Recovery rate of RCG in vitreous and aqueous humor (-x±s, n=5)

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