肾消通络方对糖尿病肾病大鼠肾脏TGF-β1/Smad信号传导通路的影响❋

丁英钧，梁文杰，庞金奎，刘洪斌，赵玉庸

(1.河北中医学院，石家庄 050200;2.河北省中西医结合肝肾病证重点实验室，石家庄 050200; 3.河北省泊头市医院，河北泊头 062150;4.河北医科大学研究生学院，石家庄 050017)

肾消通络方对糖尿病肾病大鼠肾脏TGF-β1/Smad信号传导通路的影响❋

丁英钧1，2，梁文杰1，2，庞金奎3，刘洪斌4，赵玉庸1

(1.河北中医学院，石家庄 050200;2.河北省中西医结合肝肾病证重点实验室，石家庄 050200; 3.河北省泊头市医院，河北泊头 062150;4.河北医科大学研究生学院，石家庄 050017)

目的:探讨肾消通络方对糖尿病肾病大鼠TGF-β1/Smad信号传导通路的影响。方法:将实验动物分为正常组、模型组、厄贝沙坦组及中药组4组，免疫组化法测定肾组织TGF-β1蛋白表达，RT-PCR法测定TGF-β1mRNA表达，Western blot法测定Smad2/3及Smad7的表达。结果:中药组和厄贝沙坦组TGF-β1蛋白的表达水平较模型组有所降低，TGF-β1 mRNA水平明显低于模型组，Smad2/3水平明显低于模型组，Smad7水平明显高于模型组。结论:肾消通络方可抑制TGF-β1mRNA及其蛋白的表达，同时抑制Smad2/3表达而提高Smad7的表达。

肾消通络方;糖尿病肾病;TGF-β1;Smad;信号传导

糖尿病肾病(diabetic nephropathy，DN)是糖尿病(diabetes mellitus，DM)常见并发症之一，是DM患者的主要死亡原因之一。TGF-β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)是DN发病过程中的重要细胞因子，TGF-β1/Smads信号传导通路激活是肾纤维化发生发展的重要机制［1］，故有效切断TGF-β1的信号传导是减轻和终止纤维化的关键。“肾消通络方”是在前期研究方剂“肾络通”的基础上优化而成，由黄芪、元参、黄连、丹参、鬼箭羽、金雀根、红曲、蝉蜕、地龙、乌梢蛇等组成，经前期临床和实验证实有改善肾功能、减轻肾脏组织病理改变等作用。本研究采用腹腔注射链脲佐菌素(Streptozotocin，STZ)法复制DM大鼠模型，研究肾消通络方对糖尿病肾病大鼠肾脏TGF-β1/Smad信号传导通路的影响，以探索肾消通络方的肾保护作用机制，从而为临床提供实验依据。

1 材料

1.1 动物及用药

雄性清洁级SD大鼠50只，体质量(200±20) g，由河北医科大学实验动物中心提供(合格证编号129014)。肾消通络方各药材购自国药河北乐仁堂医药连锁有限公司，每付药物共177 g浸泡30 min后共煎，煎煮2次每次30 min，将2次煎出药液混合，浓缩至约90 ml，约为含生药2 g/ml。厄贝沙坦由赛诺菲(杭州)制药有限公司生产，调制浓度为2.5 mg/ml备用。

1.2 主要试剂及仪器

链脲佐菌素(STZ)，美国Sigma公司;TGF-β1抗体，美国 Santa Cruz公司;Smad2/3抗体，美国Santa Cruz公司;Smad7抗体，美国Santa Cruz公司; CTGF抗体，美国Santa Cruz公司;PE9600型PCR扩增仪，美国PE公司;RM2245型切片机，德国LEICA公司;SIM-F140AY65型制冰机，日本SANYO公司; BX53型显微镜，日本奥林巴斯公司。

2 方法

2.1 动物模型及分组

大鼠适应性喂养1周，随机抽取10只为正常组，其余40只为造模组。造模组按空腹体质量一次性腹腔注射1%STZ 50 mg/kg制作DM模型，正常组注射等量缓冲液。72 h后，尾静脉取血测定造模组空腹血糖，高于16.7 mmol/L者为成功DM模型。对成模的33只大鼠进行随机分组:模型组、厄贝沙坦组、中药组，每组各11只。次日起灌服给药，每日8∶00，每日1次，中药组按生药20 g/ (kg·d);厄贝沙坦组按25 mg/(kg·d)给药，共12周。模型组和正常组给予等量蒸馏水，自由饮食。试验期间，模型组大鼠死亡3只，厄贝沙坦组、中药组各死亡2只。

2.2 指标检测

2.2.1 免疫组化 采用SABC法测定肾组织TGF-β1的表达，使用 BX53型显微镜和 Adobe photoshop 7.1软件采集图像。

2.2.2 RT-PCR 采用Trizol一步法提取肾组织RNA、RT反应，测试管中分别加入引物Rat TGF-β1(301 bp);上游:5′-GTCAACTGTGGAGCAACACG-3，下游:5′-CATGAGGAGCAGGAAGGGTC-3′;Rat GAPDH(594 bp):上游:5′-CCTTCATTGACCTCA ACTAC-3′，下游:5′-GGAAGGCCATGCCAGTGAGC-3′。按反应条件进行扩增，然后95℃预变性5 min，94℃变性60 s，根据引物不同要求退火，72℃延伸60 s，72℃终末延伸10 min，共30循环，电泳后紫外灯下观察结果。Quantity One凝胶软件分析目的电泳条带，以 GAPDH电泳条带为参照，待测条带与GAPDH进行对比，表示相对表达水平。

2.2.3 Western blot 测定肾组织中Smad2/3、Smad7的表达。称取500～600 mg肾组织，加蛋白抽提缓冲液1ml匀浆离心取上清。将此样品加入等体积2×SDS上样缓冲液，100℃ 3～5 min，-20℃保存待用。将8 μl样品加入预制的10%SDS-聚丙酰胺凝胶中电泳分离，采用水浴式电印迹将凝胶中的蛋白电转移至硝酸纤维素滤膜(NC膜)上。将膜置于封闭液中静止过夜，加入第一抗体，室温缓慢摇动2 h洗膜，加入第二抗体，室温缓慢摇动1 h洗膜。而后DAB显色、照相分析，使用凝胶分析软件测定各条带的平均光密度值(OD值)，待测蛋白质表达量与GAPDH表达量比值，表示蛋白质的相对表达水平。

2.3 统计学方法

采用SPSS 13.0软件进行统计分析，数值变量以均数±标准差(±s)表示。数据采用单因素方差分析，组间比较采用SNK检验，所有假设检验方法显著性水准以P＜0.05为准。

3 结果

3.1 肾消通络方对DN大鼠肾组织TGF-β1蛋白表达的影响

图1显示，免疫组化结果显示，正常组TGF-β1在肾小球、肾小管处均有少量表达;模型组、厄贝沙坦组、中药组TGF-β1的表达水平明显高于正常组;模型组在肾小球内可见TGF-β1大量表达，在内皮细胞、系膜细胞处均呈现表达增高，在细胞外基质也有散在阳性表达;厄贝沙坦组和中药组TGF-β1的表达水平较模型组有所降低，部分肾小球出现表达增高，整体水平较模型组呈现下调，厄贝沙坦组和中药组之间差异不明显。

3.2 肾消通络方对 DN大鼠肾组织 TGF-β1mRNA表达的影响

表1图2显示，模型组、厄贝沙坦组、中药组TGF-β1 mRNA水平较正常组明显升高(P＜0.05)，模型组较厄贝沙坦组、中药组TGF-β1 mRNA水平明显升高(P＜0.05)，厄贝沙坦组、中药组之间TGF-β1 mRNA水平比较差异无统计学意义(P＞0.05)。

3.3 肾消通络方对 DN大鼠肾脏 Smad2/3、Smad7表达的影响

表1图3显示，模型组的Smad2/3水平明显高于正常组(P＜0.05)，厄贝沙坦组、中药组的Smad2/3水平明显低于模型组 (P＜0.05)，而正常组、厄贝沙坦组、中药组之间Smad2/3水平比较差异无统计学意义(P＞0.05)。厄贝沙坦组、中药组的Smad7水平明显高于正常组、模型组(P＜0.05)，且中药组Smad7水平较厄贝沙坦组明显升高(P＜0.05)，正常组、模型组之间Smad7水平比较差异无统计学意义(P＞0.05)。

表1 各组大鼠肾脏TGF-β1 mRNA、Smad2/3、Smad7水平的表达(±s)

表1 各组大鼠肾脏TGF-β1 mRNA、Smad2/3、Smad7水平的表达(±s)

注:与正常组比较:▲P＜0.05;与模型组比较:*P＜0.05;与厄贝沙坦组比较:^P＜0.05

组别 例数 TGF-β1 mRNA/GAPDH Smad2/3/GAPDH Smad7/GAPDH正 常 组 10 0.4788±0.00473 0.2961±0.01224*0.2678±0.0284模 型 组 8 1.4668±0.01761▲ 0.7606±0.16494 0.3178±0.03413厄 贝 沙 坦 组 9 0.8158±0.3856＊▲ 0.3629±0.05336* 0.4679±0.04626＊▲中 药 组 9 1.0152±0.1583＊▲ 0.4664±0.05475* 0.5243±0.02824＊▲^

图1 各组大鼠肾组织TGF-β1蛋白表达(10×40)

图2 各组肾组织TGF-β1mRNA的表达

图3 各组大鼠肾脏Smad2/3、Smad7水平的表达

4 讨论

肾消通络方是基于DN“热伤气阴，肾络瘀阻”基本病机［2-3］，以“益气养阴，清热通络”为治法组方而成。方中黄芪益气健脾、利水消肿;元参滋阴清热;黄连、地锦草清热泻火解毒，药理研究二者具有降低血糖的作用;丹参、鬼箭羽、金雀根活血化瘀，金雀根药理研究具有免疫抑制、抗炎、降压等作用，可降低蛋白尿;红曲药食两用，健脾化痰，活血化瘀，具有降脂之功;蝉蜕、地龙、乌梢蛇等药化瘀通络，本方特点为采用多种虫类药，虫类走窜，入络搜剔，具有攻冲之性，善入细微孔隙之处，对于瘀血阻络、正虚邪深之痼疾其效尤著。

4.1 肾消通络方可抑制TGF-β1 mRNA及蛋白的表达

TGF-β1作用于肾细胞产生ECM，终致纤维化发生。TGF-β1/Smad途径是TGF-β1主要的作用途径［1］，因此抑制 TGF-β1表达的中药可有效拮抗TGF-β1/Smads信号传导通路，从而发挥抗纤维化作用。在多种DN的模型中，TGF-β1 mRNA及TGF-β1表达均明显升高，并伴有肾脏肥大和细胞外基质增多，临床研究显示［4］下调或抑制肾脏TGF-β1表达水平是降压药物发挥DN防治作用的重要途径。本实验结果显示，模型组大鼠 TGF-β1 mRNA及 TGF-β1表达明显升高，其含量与肾脏病理损伤程度明显相关，表明TGF-β1参与了DN的发生和进展。肾消通络方有明显的调节作用，提示对TGF-β1的干预是肾消通络方的重要作用靶点。

4.2 肾消通络方降低Smad2/3表达水平，提高Smad7表达水平

TGF-β1/Smads信号传导通路由TGF-β、TGF-β受体(transforming growthfactor-β receptor，TβR)及受体底物Smad蛋白家族信号分子组成。TGF-β1与TβR形成受体复合物，激活Smads蛋白，将信号传导至细胞核行使转录因子的功能。Smads可分为3型:①受体调节型(R-Smad)，包括Smad1、2、3、5、8、9;②共同介质型(Co-Smad)，即Smad4;③抑制型(ISmad)，即Smad6、7。其中Smad2和Smad3直接被Ⅰ型受体激酶在-SXSC末端基序的2个丝氨酸残基磷酸化，与Smad4结合成为复合物，转入核内调节靶基因的转录并产生效应［5］。Smad6、7为逆向调控因子［6］，可抑制TβRI对Smad 2和Smad 3的磷酸化，阻抗TGF-β1/Smads的信号传导，抑制纤维化。Smads蛋白家族是TGF-β1信号传导通路中的关键分子，是将信号从细胞质传导细胞核的中转分子。研究发现［7］，DM大鼠肾组织TGF-β1的表达显著增加，Smad7的表达减少;经胰岛素控制血糖后，TGF-β1的表达减少，Smad7显著上调，大鼠肾纤维化病变明显改善。Smad基因敲除，可以预防或逆转DM状态小鼠肾脏纤维化［8］。本实验结果显示，模型组大鼠Smad2/3表达水平明显升高，而Smad7表达水平较低，表明TGF-β1/Smad信号通路是DN发生的关键机制;中药组的Smad2/3表达水平显著降低，而Smad7表达水平升高，表明肾消通络方可以Smads为靶点调控TGF-β1/Smad信号通路。

总之，肾消通络方可抑制 TGF-β1 mRNA及TGF-β1的表达，同时可降低Smad2/3表达水平，提高Smad7表达水平，提示对TGF-β1/Smad信号通路的干预可能是肾消通络方的作用机制之一。

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Effects of Shenxiao Tongluo Prescription on the TGF-1/Smad Signal Transduction Pathway in the Kidney of Diabetic Nephropathy Rats

DING Ying-jun1，2，LIANG Wen-jie1，2，PANG Jin-kui3，LIU Hong-bin4，ZHAO Yu-yong1
(1．Hebei University of Traditional Chinese Medicine，Hebei Shijiazhuang 050200，China;2．Hebei Key Laboratory of Integrative Medicine on Liver-kidney patte，Hebei Shijiazhuang 050200，China;3．Hebei Botou City Hospital，Hebei Botou 062150，China;4．Graduate School of Hebei Medical University，Hebei Shijiazhuang 050017，China)

Objective:To study the effects of Shenxiao Tongluo Decoction on TGF-β1/Smad signaling pathway in rats with diabetic nephropathy.Methods:The experimental animals were divided into 4 groups:normal group，model group，irbesartan group，and Shenxiao Tongluo group. The expression of TGF-β1 in renal tissue was examined by immunohistochemical technique.The expressions of TGF-β1mRNA was detected by RT-PCR.The expressions of Smad2/3 and Smad7 were examined by Western blot.Results:The expressions of TGF-β1 in irbesartan group and shenxiao Tongluo group was lower than model group，and the expressions of TGF-β1 mRNA significantly lower than model group.The expressions of Smad2/3 was significantly lower than model group.Smad7 was significantly higher than model group. Conclusions:Shenxiao Tongluo decoction can inhibit the expressions of TGF-β1 mRNA and protein，and inhibit the expressions of Smad2/3 but promote the expression of Smad7.

Shenxiao Tongluo decoction;Diabetic nephropathy;TGF-β1;Smad;Signal transduction

R285.5

:B

:1006-3250(2015)09-1099-03

2015-02-26

河北省自然科学基金资助项目(C2011206054);河北省中医药管理局科研计划项目(2011001)

丁英钧(1972-)，男，河北无极人，教授，医学博士，从事中医糖尿病肾脏病的临床与研究。