类法尼醇X受体α基因的原核表达及多克隆抗体制备

李超燕，于 琨，朱海华，张玉娟，顾伟祯，郑文明，许 君

(1.河南农业大学生命科学学院，河南郑州450002;2.河南省商业科学研究所有限责任公司，河南郑州450002)

法尼醇X 受体(Farnesoid X receptor α，FXRα)是一种肝富集胆汁酸受体，属于核受体超家族成员，在调节肝细胞的代谢方面具有重要功能，是潜在的肝部疾病治疗的靶标分子。类法尼酯X受体(Farnesoid X receptor，FXR/NR1H4)属于配体以来的核转录因子，其在肝脏、肠道、肾脏及肾上腺中高表达［1-4］。胆汁酸是FXR的天然配体。FXR不仅调节甘油三酸酯、胆固醇及葡萄糖的代谢、调节胆酸的生物合成及其肝肠循环，而且参与肝癌和肠癌进程［5-9］。已知有2种FXR基因，分别为FXRα和FXRβ。在人类和啮齿类动物中，由于启动子的不同和RNA的选择性拼接，FXRα基因编码4种FXRα 异构体(FXRα1，FXRα2，FXRα3，FXRα4)，FXRa或者以单体的形式，或者以FXR/视黄醇X受体(FXR/RXR)异二聚体的形式与一大类的FXR反应元件结合，激活或者抑制这些元件。FXR在人类和灵长类动物中是假基因［10，11］。FXR最初作为胆汁酸受体被广泛研究，近年来，随着研究的深入，发现FXR是多功能核受体，通过与配体结合，激活一系列基因，从而调节胆汁酸、脂质、碳水化合物的代谢，维持机体稳态，并保护肝细胞、促进肝脏再生、抑制肝纤维化的发生。本实验室前期研究表明，绿茶茶多酚EGCG是核受体FXRα的调节剂，为了深入研究EGCG对FXRα影响的机制，本研究克隆了FXRα核受体基因，成功构建FXRα基因的原核表达载体，经1 mmol·L-1IPTG诱导获得了FXRα蛋白并制备了多克隆抗体，为后期研究其与EGCG的相互作用的机制奠定了基础。

1 材料与方法

1.1 材料

HepG2细胞系由中国科学院武汉病毒所提供。大肠杆菌 (E.coli)菌株DH5a、BL21和pET-28a载体由河南农大生命学院实验室保存。pMD19-T载体购自上海生工生物工程技术服务有限公司。各种限制性内切酶、Taq DNA聚合酶购自大连宝生物(TaKaRa)工程有限公司，RNA提取试剂盒、质粒小提试剂盒、反转录试剂盒及DNA片断回收试剂盒购自康为生物有限公司。卡那霉素、氨苄青霉素等购自鼎国生物工程公司，其他试剂均为分析纯。

1.2 方法

1.2.1 RNA提取及cDNA合成 复苏人肝癌细胞HepG2细胞，在含100 mL·L-1胎牛血清的DMEM培养液中37℃ 、5%CO2饱和湿度培养箱内培养之对数细胞生长，收集细胞，用TRIzol试剂盒提取mRNA。以OD260:OD280=1.8～2.0为标准检测RNA的纯度。经1.0%琼脂糖凝胶电泳后，EB染色来检测RNA的提取质量，用DNA酶I酶解消除基因组DNA的污染，纯化后的样品经逆转录酶作用反转录成cDNA。

1.2.2 FXRα基因克隆与载体构建 根据NCBI GeneBank报道的FXRα的CDS核苷酸序列，该区为FXRα基因的ORF区。设计PCR引物，并在引物两端加上所选择的酶切位点，上游引物FXRα-F:GGATCC-ATGGGATCAAAAATGAATCTCAT，下游引物 FXRα-R:CTCGAG-TCACTGCACGTCCCA GATTT。引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。采用rTaq PCR试剂盒进行PCR扩增。反应体系20 μL，按说明书配制反应体系，反应条件:95℃预变性5 min，循环:94℃变性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸90 s，30个循环，72℃延伸10 min。琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物，试剂盒回收DNA片段。

经回收纯化的DNA与pMD19-T载体于16℃过夜连接反应，连接物CaC12转化大肠杆菌DH5a感受态细胞，在含有Amp、IPTG和X-gal的LB平板上37℃培养12～16 h，挑取白色菌落摇菌12～16 h后提取质粒，筛选重组子。对重组质粒进行酶切，将酶切验证为正确的重组质粒进行测序。测序结果与原始序列一致的阳性质粒命名为pMD19-T-FXRα。

pMD19-T-FXRα及pET-28a分别用BamH I和Xhol I双酶切后进行琼脂糖凝胶电泳，分别回收相应片段，T4DNA连接酶于16℃ 过夜连接pET28a和FXRα。连接产物转化DH5a，在含卡那霉素平板筛选培养。菌落PCR和双梅切验证阳性质粒pET-28a-FXRα。

1.2.3 FXR重组蛋白的原核表达与纯化 将pET-28a-FXRα 转化 E.coil BL21(DE3)菌株，菌落PCR鉴定阳性克隆。挑阳性单菌落接入含卡那霉素的5 mL LB培养基中37℃培养，至OD600达0.6时，加入异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)，继续培养6 h后，12 000 r·min-1离心收集菌体，加入1 mL的Binding Buffer重悬菌体，超声波破碎收集沉淀和上清，ddH2O重悬沉淀，分别对上清和沉淀进行SDS-PAGE，将大量诱导的菌体重悬于PBS(50 mmol·L-1Tris·HCl;pH 值 8.0;2 mmol·L-1EDTA)。低温超声破碎，离心后，沉淀用含6 mol·L-1盐酸胍的Binding Buffer重悬2次超声破碎，破碎后离心，将上清过Ni-NTA树脂进行纯化。SDSPAGE检测纯化蛋白，将纯化蛋白稀释至0.5 g·L-1。4℃冰柜中透析复性，并超滤浓缩，SDSPAGE检测复性蛋白。

1.2.4 抗体制备与效价测定 将纯化复性后的重组蛋白(600 g·L-1)，与弗氏完全佐剂1∶1混匀，总量为1 mL的混合物多点注射新西兰白兔背部。1次免疫7 d后2次免疫。2～3周后以弗氏不完全佐剂3次免疫。7 d后在兔子耳动脉取血。收集血清于37℃放置2 h后，4℃过夜，10 000 r·min-1，4℃离心10 min，收集血清，分装并-80℃保存。将不同蛋白样品进行 SDS-PAGE后，转PVDF膜，Western Blot检测抗体特异性。

采用免疫斑点法检测抗体效价，分别将10、100、1 000 ng抗原滴加到NC膜上，膜37℃烘干后，封闭液摇动封闭1 h，TBST洗膜3次后，将稀释度分别为1 000、2 000、4 000、8 000、12 000 倍的抗血清加入已点样的NC膜，37℃孵育2 h，TBST洗3次，HRP-DAB底物显色试剂盒显色。

2 结果与分析

2.1 HepG2 RNA 提取

以HepG2为材料提取RNA，然后用DNaseI消化以去除基因组DAN污染并纯化消化过的RNA。纯化后的RNA进行1%琼脂糖凝胶电泳，检测其纯度及完整性。从图1-A中知:28 S及18 S 2条RNA主带清晰明亮，具有较高纯度及完整性，可用于反转录。

2.2 PCR 扩增 FXRα

以HepG2细胞系中提取的RNA为模板，采用RT-PCR方法克隆FXRα基因获得。在1.0 kb与2.0 kb之间有1条大小与目的基因一致，约1 539 bp的条带，表明已克隆得到目的基因，结果如图1-B。

2.3 克隆载体与表达载体的构建

将PCR产物切胶回收，与pMD19-T过夜连接，连接产物转化感受态细胞DH5a。挑取单克隆过夜摇菌后，菌液PCR鉴定阳性克隆，并将其命名为pMD19-T-FXRα，提取质粒用限制性内切酶BamH I、Xhol I酶切验证(图2)，结果表明插入基因大小正确，与理论设计一致。

图1 细胞HepG2 RNA检测与FXRα PCR扩增Fig.1 The agarose gel electrophoresis of RNA extraction and RCR products of FXRα specific primers

图2 重组克隆载体pMD19-T-FXRα双酶切验证Fig.2 Identification of the recombinant pMD19-T-FXRα by double digestion

2.4 重组表达载体酶切验证

质粒pMD19-T-FXRα与pET-28a分别酶切后，pMD19-T-FXRα回收小片段，pET-28a回收大片段。回收产物经过夜连接后转化感受态细胞 DH5α。挑取单克隆过夜摇菌，菌液PCR鉴定阳性克隆，并将其命名为pET-28a-FXRα。提取质粒，双酶切后电泳检测，结果表明:基因插入正确，与理论设计一致。结果如图3。

2.5 FXR α重组蛋白的原核表达及纯化

将重组表达质粒和空载体分别转化大肠杆菌BL21，进行诱导后，经SDS-PAGE分析，在相对分子量58.6 kDa处有1条很明显的条带，与预期目的条带大小一致，而空载体则无此条带;菌体经超声破碎后，沉淀中有明显的特异条带，而上清中没有(图4-A)，表明重组蛋白质以包涵体形式表达为主。收集表达的菌体，超声破碎后的沉淀用含盐

图3 重组克隆载体pET-28a-FXRα双酶切验证Fig.3 Identification of the recombinant pET-28a-FXRα by double digestion

酸胍的Binding Buffer溶解沉淀，再次超声波破碎，离心，滤膜过滤，镍柱孵育，洗涤，洗脱，收集目的蛋白，复性后的纯化蛋白SDS-PAGE电泳检测。在66.4 kDa与44.3 kDa之间有1条带，符合预期试验结果，为目的条带(图4)。

2.6 多克隆抗体的制备与效价测定

FXRα蛋白免疫新西兰白兔制备出的多克隆抗体，采用Western Blot鉴定其特异性。结果显示，在大小为58 kD的位置有一特异性条带，说明抗体制备成功。采用HRP免疫斑点试验方法测定效价，与阴性对照相比，所制备的多克隆抗血清稀释至8 000倍时，依然可以清楚地观察到杂交斑点，稀释至12 000倍时，较大样量时也可观察到杂交现象，说明多克隆抗血清可以有效结合免疫原，效价为1∶8 000 ～1∶12 000(图5)。

图4 重组FXRα蛋白表达(A)与纯化(B)的SDS-PAGE检测Fig.4 SDS-PAGE of recombinant FXRα expression(A)and purification(B)

图5 多克隆抗血清的western blot检测(A)和效价测定(B)Fig.5 Western Blot of polyclonal anti-sura(A)and its titer determination(B)

3 讨论

1995年SEOL等利用酵母双杂交技术，以人的核受体RXRα的配体结合域为诱饵筛选小鼠的肝脏cDNA文库，获得数个相互作用蛋白，其中之一被命名为RIP14(RXR-interacting protein 14)。而后，FORMAN等从大鼠的肝脏cDNA文库中筛选获得小鼠RIP14的同源蛋白并发现法尼醇可以激活大鼠的RIP14，因此大鼠的RIP14被命名为法尼醇X受体(FXR)。最初FXR被认为是“孤儿受体”，1999年多个研究组发现胆汁酸是FXR的内源性配体［14-16］。因此，FXR也称作胆汁酸受体-BAR(bile acid receptor)。体外试验表明胆汁酸在生理浓度下，可以激活FXR。最初，FXR作为胆汁酸受体被广泛研究，近年来，随着研究的深入，发现FXR不仅在胆汁酸代谢中起枢纽的作用，而且在脂质代谢、碳水化合物代谢、防止肠道细菌的过度生长和保持肠道黏膜的完整性、保护肝细胞、抑制肝纤维化的发生和进展、促进肝脏再生等多方面起着重要的作用［17］。

本试验通过提取HepG2细胞mRNA，反转录成cDNA，PCR得到目的基因，连接到克隆载体PMD-19T上转化到大肠杆菌DH5α里，将所克隆的FXRα构建原核表达载体PET-28a-FXRα，转化BL21，经IPTG诱导，重组FXRα蛋白在菌体中以包涵体形式表达。重组蛋白经镍柱纯化，透析复性，免疫兔子，制备了高效价的多克隆抗血清。为进一步研究FXRα与其它因子的相互作用奠定基础。

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