参苓白术散加减方对结肠黏膜组织水通道蛋白4、水通道蛋白8表达的影响

康楠 王凤云 陈婷 王晓鸽 朱恩林 唐旭东

脾的主要生理功能为运化水谷、运化水液，输布精微，脾虚证则表现为脾的运化、升清功能失职，致使水谷、水液不运，水湿潴留，化源不足，进而出现腹胀腹痛、食少纳呆、便溏腹泻、浮肿等一系列的症状。泄泻是脾虚证的主症，是因脾虚失运，清浊不分，水湿下注而成。脾虚证的现代研究多从胃肠道动力［1］、胃肠激素水平［2］、黏膜免疫［3］、能量代谢［4］等方面进行探讨，为阐明脾虚证的科学内涵提供了诸多依据。而从水液代谢的角度探讨脾虚泄泻的发生机制的研究还相对较少，本研究拟从这一角度出发，选择胃肠道典型的水通道蛋白为研究对象，观察健脾经典方剂参苓白术散对脾虚泄泻模型大鼠结肠黏膜AQP4、AQP8 的表达情况的影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物

3 周龄清洁剂级健康雄性Wistar 大鼠42 只，北京斯贝福实验动物科技有限公司，许可证号:SCXK(京)2011-0004。

1.2 主要药品与试剂

参苓白术散加减方浸膏干粉(每克干粉含生药量5.64g)，由中国中医科学院西苑医院药剂科提供;蒙脱石散，博福-益普生(天津)制药有限公司，3 g* 10袋，产品批号:F17193。AQP4 一抗(SⅠGMA，A5971)，AQP8 一抗(LⅠBio，LS-C3811/29843)，兔超敏二步法免疫组化检测试剂(北京中杉金桥生物技术有限公司)，柠檬酸盐缓冲液(北京中杉金桥生物技术有限公司)，抗利尿激素ELⅠSA 试剂盒(Cayman，583951)。

1.3 仪器

Olympus bx51 显微镜;LEⅠCA EM TP 组织包埋机;LEⅠCA RM 2235 组织切片机;LEⅠCA HⅠ1220 烤片机;THERMO MK3 全自动酶标仪;Olympus Anymicro DSSTM 图像采集系统。

1.4 分组与给药

将大鼠随机分为正常组、模型组、蒙脱石散组、加减参苓白术散高剂量组、中剂量组、低剂量组，每组7 只，分别按照10 mL/kg 给予生理盐水、蒙脱石散溶液(0.9 g/kg)、加减参苓白术散(4.6g/kg)、加减参苓白术散(2.3 g/kg)、加减参苓白术散(1.2g/kg)，每天1 次，连续灌胃7 天。

1.5 模型建立

采用高乳糖饲料喂养叠加水环境小平台站立法［5-7］建立脾虚泄泻大鼠模型，连续高乳糖饲料喂养幼龄Wistar 大鼠14 天，每天将大鼠置于特制的箱中小平台上9 小时，平台周边注满水，大鼠在平台上可以自由活动，一旦大鼠进入睡眠状态就会因为肌肉舒张、松弛而落入水中。

1.6 取材及处理

连续灌胃给药7 天后，4%水合氯醛腹腔麻醉，腹主动脉取血，离心取上清。冰上取结肠组织，至肛门向上2 cm 开始，取远端结肠3 cm，近端结肠3 cm，用生理盐水将肠内容物清洗干净后，-80℃保存。

1.7 观测指标

观察各组大鼠腹泻率、各组大鼠血清抗利尿激素含量、结肠组织AQP4 和AQP8 的表达。血清抗利尿激素含量检测采用ELⅠSA 方法检测，根据说明书进行，基本步骤如下:配制标准品，依次梯度稀释标准品，加样，孵育，洗涤，加酶标试剂，孵育，洗涤，加工作液显色，终止显色，检测读取OD 值，绘制标准曲线，计算相应样品浓度。AQP4 和AQP8 的表达采用免疫组化方法检测，基本步骤如下:脱蜡、预处理组织切片，3%H2O2去离子水孵育，PBS 冲洗，一抗孵育，PBS 冲洗，二抗孵育，PBS 冲洗，DAB 显色，自来水冲洗，苏木素复染，分化，自来水冲洗，蓝化，脱水干燥，透明，封片，晾干后观察。

1.8 统计学处理

数据采用SPSS 17.0 统计软件进行分析。数据以表示，各组数据先进行正态性检验，采用Shapiro-Wilk 检验方法，方差齐性检验采用Levene 检验方法，若数据符合正态分布且方差齐，则用单因素方差分析(One-Way ANOVA)，组间比较用LSD 法;以P ＜0.05 为差异有统计学意义的界限。若数据不符合正态分布或方差不齐，则用非参数检验(Kruskal-Wallis 检验)，组间两两比较用Mann-Whitney 法，由于本实验分为6 个组，按照公式重新计算P =2 ×0.05/k(k-1)=0.003，故以P ＜0.003 为有统计学差异。

2 结果

2.1 对大鼠腹泻情况的影响

模型复制成功后，大鼠腹泻率为100%，停止造模并给予治疗7 天后，模型组的大鼠大便腹泻程度较前有所好转，但仍有42.86%的大鼠存在腹泻情况，而药物干预组的大鼠，只有中剂量组的1 只大鼠存在轻微腹泻，高低剂量组及西药组大鼠腹泻情况已消失。(腹泻率=腹泻动物数/该组动物总数×100%;干便和稀便的区分以滤纸上有无污迹为标准。)

2.2 对大鼠血清抗利尿激素含量的影响

高中低剂量组、蒙脱石散组、模型组、正常组血清抗利尿激素含量进行正态性检验，符合正态分布，但方差不齐(P =0.009 ＜0.05)，故采用非参数检验(Kruskal-Wallis)，组间有显著性差异(P=0.008 ＜0.05)，组间两两比较用Mann-Whitney法。与正常组比较，模型组大鼠血清抗利尿激素的含量明显降低，有统计学意义(P =0.002 ＜0.003);与模型组比较，加减参苓白术散高剂量组的大鼠血清抗利尿激素的含量明显升高，有统计学差异(P=0.002 ＜0.003)。见表1。

表1 加减参苓白术散对大鼠血清抗利尿激素含量的影响(n=6)

2.3 对结肠黏膜组织AQP4 表达的影响

与正常组比较，模型组大鼠结肠黏膜组织AQP4 的表达明显降低;与模型组比较，高中低剂量组及西药组均可以提高结肠黏膜组织中AQP4 的表达。见图1。

图1 加减参苓白术散对结肠黏膜组织AQP4 表达的影响(×200)

2.4 对结肠黏膜组织AQP8 表达的影响

与正常组比较，模型组大鼠结肠黏膜组织AQP8 的表达明显降低;与模型组比较，高低剂量组和西药组可提高AQP8 的表达，中剂量组改善不明显。见图2。

图2 加减参苓白术散对结肠黏膜组织AQP8 表达的影响(×200)

3 讨论

腹泻的发生，可因肠腔内渗透压升高、水电解质分泌过度、炎性渗出增多及肠蠕动加快，而最终的状态都是肠腔内的液体量增多。脾虚泄泻为虚证，大便性状多为水样便或者溏薄如酱，且夹有未消化的食物。脾虚泄泻发生时大便中的水分的含量必然是明显增加的，水分的吸收与分泌可以分为细胞旁途径和跨细胞途径，无论哪种途径都是依靠细胞膜两侧的渗透压差来驱动的。其中细胞旁途径，水分主要是通过细胞间隙进行转运;跨细胞途径水分则需要特定的通道进出细胞，即水通道蛋白［8］。

水通道蛋白是由Agre 等［9］在1992年发现的，和经典的离子通道有些不同，水通道蛋白不存在开放和关闭的功能状态，也不受温度和脂质膜成分的影响，只要有渗透压梯度就有水分子顺渗透压梯度通过水孔通道［10］。根据对水和其他溶质的通透性，水通道蛋白又分成了水通道和水甘油通道，水通道只对水有通透性，水甘油通道还对其他小分子如甘油等同样具有通透性，AQP4 和AQP8 属于前者。AQP4 定位在细胞的基底膜［11］，有高度快速转运水的能力，是其他水通道蛋白通透性的3 ～4 倍［12］。AQP8 定位在细胞的顶膜下的细胞质内［13］，且研究发现AQP4、AQP8 的表达从结肠隐窝到表面逐渐增加，对水的渗透性也逐渐升高［14］。很多研究表明，AQP4、AQP8 参与了肠道对水分的吸收过程［15-17］，在诸多疾病［18-20］的发生过程中也起到了重要的作用，比如说霍乱引起的腹泻、肠易激综合征、克罗恩病等。

本研究中以高乳糖饲料喂养法叠加小平台站立法复制脾虚泄泻模型，大鼠被迫劳倦过度且饮食不节，造成脾虚，引起腹泻。造模成功后再给予经典的健脾方剂参苓白术散的加减方进行治疗，并以蒙脱石散做为对照药物。实验结果表明，与正常组相比，模型组大鼠的AQP4 和AQP8 在结肠黏膜组织上皮细胞的表达均降低，这说明AQP4、AQP8 的表达降低可能与腹泻的发生有关。与参苓白术散高中低剂量组及西药组比较，给予干预后腹泻明显减轻的同时AQP4、AQP8 的表达也都上升，这进一步证明了腹泻发生与AQP4、AQP8 的表达降低有关，健脾方剂参苓白术散加减方可能可以通过上调AQP4、AQP8 的表达，促进水分吸收，进而发挥其止泻的作用，疗效与西药蒙脱石散相当。本研究小组拟在下一步的工作中，添加“急性感染性腹泻(非脾虚)组”以及“非健脾中药组”进行模型及药物反证，针对“AQP4、AQP8 是否为脾虚泄泻发生的分子生物学基础之一”的问题做进一步研究。

另外，本研究还检测了各组大鼠血清中抗利尿激素的含量，结果表明与正常组比较，模型组大鼠血清抗利尿激素的含量显著降低(P ＜0.01)，与模型组比较，高剂量组抗利尿激素含量明显上调(P ＜0.01)。抗利尿激素是机体调节水液代谢的重要激素，主要作用于远曲小管和集合管，提高对水的通透性，促进水的吸收。目前研究发现其受体分布于血管平滑肌、远曲小管、集合管、垂体及胰腺［21］，以及某些肿瘤细胞上也有抗利尿激素受体的表达［22］，尚未发现肠道上皮细胞有抗利尿激素受体的表达。脾虚腹泻大鼠血清抗利尿激素含量降低，这是否与脾虚证有关，或者与肠道AQPs 的表达变化是否有关，尚待进一步的探讨。

［1］孟旸，曲瑞瑶，李梦燕，等.实验性脾虚证结肠动力及胃肠肽和一氧化氮合酶改变［J］.世界华人消化杂志，2000，8(8):933-935.

［2］张仲林，臧志和，钟玲，等.六君子汤对脾虚证大鼠胃肠激素影响的实验研究［J］.中成药，2010，32(4):659-661.

［3］赵荣华，谢鸣，李聪，等.肝郁、脾虚和肝郁脾虚证模型大鼠的免疫功能变化［J］.北京中医药大学学报，2013，36(12):821-824.

［4］杨泽民，陈蔚文.脾虚证与物质能量代谢紊乱相关性研究进展［J］.广州中医药大学学报，2012，29(3):332-336.

［5］白世敬，李峰，唐旭东，等.功能性腹泻脾虚证动物模型制作方法［J］.辽宁中医药大学学报，2015，17(1):86-88.

［6］Wanjihia V W，Ohminami H，Taketani Y，et al.Ⅰnduction of the hepatic stearoyl-CoA desaturase 1 gene in offspring after isocaloric administration of high fat sucrose diet during gestation［J］.J Clin Biochem Nutr，2013，53(3):150-157.

［7］Suchecki D，Tufik S.Social stability attenuates the stress in the modified multiple platform method for paradoxical sleep deprivation in the rat［J］.Physiol Behav，2000，68(3):309-316.

［8］Fischbarg J.Fluid transport across leaky epithelia:central role of the tight junction and supporting role of aquaporins［J］.Physiol Rev，2010，90(4):1271-1290.

［9］Zeidel M L，Ambudkar S V，Smith B L，et al.Reconstitution of functional water channels in liposomes containing purified red cell CHⅠP28 protein［J］.Biochemistry，1992，31(33):7436-7440.

［10］Preston G M，Carroll T P，Guggino W B，et al.Appearance of water channels in Xenopus oocytes expressing red cell CHⅠP28 protein［J］.Science，1992，256(5055):385-387.

［11］Wang K S，Ma T，Filiz F，et al.Colon water transport in transgenic mice lacking aquaporin-4 water channels［J］.Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol，2000，279(2):G463-G470.

［12］Yang B，Verkman A S.Water and glycerol permeabilities of aquaporins 1-5 and MⅠP determined quantitatively by expression of epitope-tagged constructs in Xenopus oocytes［J］.J Biol Chem，1997，272(26):16140-16146.

［13］Elkjaer M L，Nejsum L N，Gresz V，et al.Ⅰmmunolocalization of aquaporin-8 in rat kidney，gastrointestinal tract，testis，and airways［J］.Am J Physiol Renal Physiol，2001，281 (6):F1047-F1057.

［14］Yang B，Song Y，Zhao D，et al.Phenotype analysis of aquaporin-8 null mice［J］.Am J Physiol Cell Physiol，2005，288(5):C1161-C1170.

［15］Laforenza U，Cova E，Gastaldi G，et al.Aquaporin-8 is involved in water transport in isolated superficial colonocytes from rat proximal colon［J］.J Nutr，2005，135(10):2329-2336.

［16］Hamabata T，Liu C，Takeda Y.Positive and negative regulation of water channel aquaporins in human small intestine by cholera toxin［J］.Microb Pathog，2002，32(6):273-277.

［17］Wang K S，Ma T，Filiz F，et al.Colon water transport in transgenic mice lacking aquaporin-4 water channels［J］.Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol，2000，279(2):G463-G470.

［18］Zahn A，Moehle C，Langmann T，et al.Aquaporin-8 expression is reduced in ileum and induced in colon of patients with ulcerative colitis［J］.World J Gastroenterol，2007，13(11):1687-1695.

［19］王晓玲，王俊平.腹泻大鼠结肠水通道蛋白8 表达的研究［J］.中国药物与临床，2008，8(4):295-297.

［20］李立胜，王俊平.洛哌丁胺对腹泻模型大鼠结肠水通道蛋白4 表达的影响［J］.胃肠病学和肝病学杂志，2013，22(12):1225-1227.

［21］Koshimizu T A，Nakamura K，Egashira N，et al.Vasopressin V1a and V1b receptors:from molecules to physiological systems［J］.Physiol Rev，2012，92(4):1813-1864.

［22］杨佳.血管加压素受体V_2、V_3 在ACTH 分泌性肿瘤上的表达及功能［D］.上海:复旦大学，2013.