微波辅助双水相提取千斤拔总黄酮的工艺研究

陈 帅，王慧竹，朱 琳，王 冠，钟方丽*

（1.吉林化工学院 化学与制药工程学院，吉林 吉林 132002；2.沈阳药科大学 药学院，辽宁 沈阳 110016）

0 引言

千斤拔隶属于豆科（Leguminosac）蝶形花亚科（Papilionoideae），《中华人民共和国药典》一部中收载千斤拔为豆科植物蔓性千斤拔Moghania philippinensis（Merr.et Rolfe）Li.、大叶千斤拔Moghania macrophylla（Willd.）O.Kuntze 或锈毛千斤拔Moghania ferruginea（Wall.ex Benth.）Li.的干燥根[1]，广泛分布于我国的东南、中南、西南地区，其中蔓性千斤拔在11 个省区均有分布，大叶千斤拔在除湖北、湖南外的9 个省区均有分布.《中药大辞典》记载“千斤拔味甘辛，微苦，性温平，无毒，具有祛风利湿、消瘀解毒之功效，可治疗风湿痹痛，慢性肾炎、跌打损伤、痈肿和喉蛾等症”[2].国内外学者对千斤拔化学成分及生物活性的研究报道很多，其化学成分主要含有黄酮类、香豆素类、萜类、挥发油、甾醇类等，其中以黄酮类化合物为主[3-5]，现代药理研究及临床试验表明千斤拔总黄酮不仅对各种妇科炎症有显著疗效，还具有类雌激素作用以及良好的抗血栓、抗炎镇痛、抗氧化的作用，对神经系统的损伤也具有一定的保护作用[6-8].因此，研究千斤拔总黄酮的提取技术在心脑血管疾病及妇科病的新药研制方面有着比较大的开发空间及市场需求，必将会带来良好的经济与社会效益.

从中药中提取总黄酮的传统提取方法有有机溶剂热回流提取法、室温浸提法、索氏提取法等，微波辅助萃取技术近年来广泛应用于中药活性成分的提取，相对于传统的提取方法具有萃取时间短，溶剂用量少，提取效率高，产品质量好，成本低等优点[9]，基于乙醇与无机盐形成的双水相体系与传统的双水相体系相比，成本更低，并且萃取相不含黏度大、难处理的聚合物，同时可表现出良好的分离性能[10].通过检索文献未发现有关采用双水相提取千斤拔总黄酮的报道，为此，本试验对辅助乙醇-硫酸铵双水相提取千斤拔中总黄酮的提取条件进行了研究，以期为千斤拔总黄酮在医药工业中的应用及有关千斤拔新药的研发提供理论依据.

1 材料与方法

1.1 仪器与设备

TU-1950 紫外分光光度计：北京普析通用仪器有限责任有限公司；SHZ-D 循环水真空泵：河南巩义市英峪仪器厂；RE-3000A 旋转蒸发仪：上海亚荣生化仪器厂；KQ250 超声波清洗器：昆山超声仪器有限公司；MAS-Ⅱ微波合成萃取反应仪：上海新仪微波化学科技有限公司；FA2204B 电子天平：上海精科天美科学仪器有限公司；RT-08 多功能粉碎机：荣聪精密科技有限公司.

1.2 材料与试剂

千斤拔药材：吉林市吉林大药房，经笔者鉴定为蔓性千斤拔Moghania philippinensis（Merr.et Rolfe）Li.的根；芦丁对照品：中国药品生物制品检定所；乙醇、硫酸铵：均为分析纯.

1.3 试验方法

1.3.1 乙醇-硫酸铵双水相体系的建立

准确配制一定浓度的硫酸铵水溶液，吸取一定体积于50 mL 比色管中，然后用无水乙醇滴定至刻度，确保溶液混合后分相，即得50 mL 乙醇-硫酸铵双水相体系的混合液.

1.3.2 对照品溶液的制备

精确称量芦丁对照品10.0 mg，置于50 mL 容量瓶中，加60%乙醇溶解，定容即得质量浓度0.2 mg/mL 的芦丁对照品溶液.

1.3.3 供试品溶液的制备

取千斤拔粉末1.0 g 置于100 mL 具塞锥形瓶中，加入50 mL 乙醇-硫酸铵双水相体系混合溶液，静置40 min，按既定条件进行微波提取后，过滤，滤液转入60 mL 分液漏斗中，待完全分相后，取上清液，减压回收溶剂后，以60%乙醇溶液定容至25 mL 容量瓶中，摇匀，即得供试品溶液.

1.3.4 线性关系的考察

精确量取芦丁对照品溶液0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL 分别置于10 mL 容量瓶中，然后分别加入5 %亚硝酸钠0.4 mL，放置6 min 后，加10%硝酸铝0.4 mL，放置6 min 后，再分别加4 %氢氧化钠4 mL，用60%乙醇定容，摇匀，放置15 min后，在504 nm 处测定吸光度A，以浓度C 为横坐标，以吸光度值A 为纵坐标，绘制标准曲线，得回归方程为A=9.068 C＋0.001 2，相关系数为0.999 8，结果表明芦丁在20～100 μg·mL-1范围内与吸光度线性关系良好.

1.3.5 总黄酮得率的测定

精确吸取“1.3.3”中供试品溶液1 mL，置于10 mL 容量瓶中，60%乙醇溶液定容.按“1.3.4”方法测定吸光度，根据标准曲线方程计算总黄酮浓度，并按公式（1）计算总黄酮得率.

1.3.6 单因素试验

以乙醇体积分数、硫酸铵加入量、微波时间、微波功率为主要影响因素进行单因素试验，考察各个因素对千斤拔总黄酮得率的影响.

1.3.6.1 乙醇体积分数对总黄酮得率的影响

固定硫酸铵加入量为0.3 g/mL，微波时间为10 min，微波功率为500 W，考察乙醇体积分数（29%、33%、38%、41%、44%）对总黄酮得率的影响.

1.3.6.2 硫酸铵加入量对总黄酮得率的影响

固定乙醇体积分数为41%，微波时间为10 min，微波功率为500 W，考察硫酸铵加入量（0.2 g/mL、0.25 g/mL、0.3 g/mL、0.35 g/mL、0.4 g/mL）对总黄酮得率的影响.

1.3.6.3 微波时间对总黄酮得率的影响

固定乙醇体积分数为41%，硫酸铵加入量为0.25 g/mL，微波功率为500 W，考察微波时间（5 min、10 min、15 min、20 min、25 min）对总黄酮得率的影响.

1.3.6.4 微波功率对总黄酮得率的影响

固定乙醇体积分数为41%，硫酸铵加入量为0.25 g/mL，微波时间为15 min，考察微波功率（300 W、400 W、500 W、600 W、700 W）对总黄酮得率的影响.

1.3.7 试验设计与数据处理

在单因素试验基础上，选取乙醇体积分数、硫酸铵加入量、微波时间、微波功率4 个因素为自变量，以总黄酮得率为响应值，根据CCD（Central Composite Design）试验设计原理，设计4 因素3 水平响应面法优化提取工艺[12-13]，以-1、0、1 编码自变量低、中、高水平，因素与水平见表1.

1.3.8 数据处理与统计分析

单因素试验结果和响应面试验结果采用SAS9.4 软件进行统计分析，文中所有图表采用Origin 9.2 软件进行绘制.

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

2.1.1 乙醇体积分数对总黄酮得率的影响

从图1 可以看出，总黄酮得率随乙醇体积分数的增大呈现逐渐上升的趋势，当乙醇体积分数为41%时总黄酮得率最大，之后，随着乙醇体积分数继续增大，总黄酮得率呈下降趋势，为了进一步考察乙醇体积分数对总黄酮得率的影响，选择乙醇体积分数为38%、41%、44%进行响应面试验设计.

图1 乙醇体积分数对总黄酮得率的影响Fig.1 Effect of ethanol concentration on total flavonoids yield

2.1.2 硫酸铵加入量对总黄酮得率的影响

从图2 可以看出，随着硫酸铵加入量的增大，总黄酮得率呈上升趋势，当加入量为0.25 g·mL-1时，得率达到最大值，随后随加入量的继续增加总黄酮得率呈下降趋势.为了进一步考察硫酸铵加入量对总黄酮得率的影响，选择硫酸铵加入量为0.2 g·mL-1、0.25 g·mL-1、0.3 g·mL-1进行响应面试验设计.

2.1.3 微波时间对总黄酮得率的影响

从图3 可以看出，微波时间对千斤拔总黄酮得率的影响很大，开始时总黄酮得率随微波时间的延长而增大，当微波时间为15 min 时，得率达到最大值，之后微波时间继续延长，但总黄酮得率反而下降.可能是由于提取时间的延长增加了其他非黄酮类化合物的溶出.为了进一步考察微波时间对总黄酮得率的影响，选择微波时间10 min、15 min、20 min 进行响应面试验设计.

图2 硫酸铵加入量对总黄酮得率的影响Fig.2 Effect of addition amount of ammonium sulfate on total flavonoids yield

图3 微波时间对总黄酮得率的影响Fig.3 Effect of microwave time on total flavonoids yield

2.1.4 微波功率对总黄酮得率的影响

从图4 可以看出，总黄酮得率随微波功率的增加呈先增大后减小的趋势，当微波功率达到500 W 时，总黄酮得率最高，为了进一步考察微波功率对总黄酮得率的影响，选择微波功率400 W、500 W、600 W 进行响应面试验设计.

图4 微波功率对总黄酮得率的影响Fig.4 Effect of microwave power on total flavonoids yield

2.2 响应面试验

2.2.1 响应面试验设计与结果

利用SAS9.4 软件对表2 数据进行回归分析[10]，得到以总黄酮得率Y 为响应值，自变量为乙醇体积分数（A）、硫酸铵加入量（B）、微波时间（C）、微波功率（D）的多元二次回归方程：Y=-24.03+104.20A-9.04B-0.17C+0.03D-173.53A2+170.42AB+0.34AC+0.002 7AD-129.97B2+0.13BC+0.006 6BD-0.007 6C2+0.000 551CD-0.000 042D2.对此回归模型进行显著性检验及方差分析，结果见表3 和表4.

由表3 可知，各因素对总黄酮得率的影响显著顺序为：乙醇体积分数＞微波时间＞微波功率，三者的P 值都小于0.01，均达到了极其显著水平，因素硫酸铵加入量的P＞0.05，因此硫酸铵加入量对总黄酮得率的影响不显著.从表3 还可以看出，乙醇体积分数与硫酸铵加入量的交互作用和微波时间与微波功率的交互作用对总黄酮得率的影响显著.由表4 可知：回归方程的P＜0.000 1，说明回归方程的总模型对总黄酮得率的影响均极其显著[14-15]；方程的决定系数为0.960 8，说明响应值的变化有96.08%来源于所选变量，模型拟合度好，失拟项P＞0.05，说明回归模型中无失拟因素存在，因此回归方程可以较准确地描述各试验因素与总黄酮得率之间的关系.

表2 响应面试验方案与结果Table 2 Scheme and experimental results of response surface design

表3 回归方程参数值及显著性检验Table 3 Significance test for the estimation of fitted regression

表4 回归方程的方差分析Table 4 Variance analysis of the fitted quadratic polynomial

2.2.2 响应曲面分析

为了更加直观地表达两个因素同时对总黄酮得率的影响，固定两个因素的值为零水平对应的值，仅考虑另外两个因素对总黄酮得率的影响，根据回归方程绘制响应曲面图和等高线图，结果如图5 所示，从图5 可以直观地看出各因素对总黄酮得率的影响，曲面越陡峭，表明总黄酮的得率受该因素影响较大；从等高线可以看出最佳的提取工艺的条件在圆心处[16-19].从图5 可以看出，对总黄酮得率影响比较大的因素为乙醇体积分数，其次为微波时间和微波功率，乙醇体积分数与硫酸铵的交互作用和微波时间与微波功率的交互作用对总黄酮得率的影响显著，这与表3 的分析结果相吻合.

利用SAS 软件RSREG 语句对模型进行典型性分析，得到微波辅助双水相法提取千斤拔总黄酮的最佳工艺条件为：乙醇体积分数41.25%、硫酸铵加入量0.28 g·mL-1、微波时间20.81 min、微波功率553.56 W，在此工艺条件下总黄酮得率预测值为6.67 %，但考虑到实际情况，将最佳工艺条件修正为：乙醇体积分数41%、硫酸铵加入量0.28 g·mL-1、微波时间21 min、微波功率550 W.在此修正工艺条件下进行验证试验，重复5 次，结果如表5 所示.

表5 千斤拔总黄酮最佳提取工艺验证试验结果Table 5 The experimental results of extracting total flavonoids under the optimum extraction process

图5 因素交互作用对总黄酮得率影响的响应曲面和等高线Fig.5 Response surface plot and contour line of the effect of interaction of factors on the extraction yield of total flavonids

由表5 可以看出，5 次工艺验证试验的总黄酮平均得率为6.64%，平均得率与理论得率的差值仅占理论得率的0.45%，由此可知回归模型较好地反映了总黄酮的提取工艺条件，同时也说明了该最佳工艺条件的稳定性，并且与文献[20]报道的超声波辅助乙醇回流法提取千斤拔总黄酮的工艺相比（总黄酮得率3.0%），微波辅助双水相法提取总黄酮的得率更高.

3 结论

本文采用微波辅助双水相法提取千斤拔总黄酮，以总黄酮得率为响应值，以乙醇体积分数、硫酸铵加入量、微波时间、微波功率为考察因素，利用响应面法对总黄酮提取工艺的参数进行优化.结果表明，千斤拔总黄酮的最佳提取工艺条件为：乙醇体积分数41%、硫酸铵加入量0.28 g·mL-1、微波时间21 min、微波功率550 W，在此工艺条件下千斤拔总黄酮的实际得率为6.64%，与理论预测值接近，并且高于文献报道的采用超声波辅助乙醇回流提取千斤拔中总黄酮的得率，因此可以利用响应面法优化双水相辅助微波法提取千斤拔总黄酮，试验得到的最佳工艺条件对千斤拔总黄酮在医药工业中的应用及有关千斤拔新药的研发提供了理论依据.

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