半边旗提取物5F联合5－Fu对A/J小鼠诱发性肺癌的影响

叶 华，刘 义，吴科锋，李 立，郑学宝

(广东天然药物研究与开发重点实验室，广东医学院，广东 湛江 524023)

肺癌已成为我国恶性肿瘤首要的死亡原因，占全部恶性肿瘤死亡的22.7%，且发病率和死亡率仍在继续迅速上升，目前我国肺癌发病率每年增长26.9%［1］。大量的流行病学研究证实吸烟与肺癌发生的密切关系，且我国吸烟人口正呈现年轻化、低龄化的趋势。课题组证实半边旗提取物5F(11α－羟基－15－氧－16－烯－对映贝壳杉烷－19－酸)对诱发性肺癌特别是由吸烟引起的肺癌具有较好的抑制作用［2］。我们进一步观察5F与5－氟尿嘧啶(5－Fu)联合应用对A/J小鼠诱发性肺癌的影响，探讨5F与5－Fu联合用药的可行性。

1 材料和方法

1.1 材料 5F干粉由本实验室(广东天然药物研究与开发重点实验室)提供，经丙二醇溶解，蒸馏水稀释，制成丙二醇体积分数为0.15%、5F质量浓度为1000 mg·L－1的储备液，除菌过滤后冷藏保存，实验时再以培养基稀释至所需浓度(丙二醇最终浓度≤0.012)。A/J小鼠，6 周龄，体重 18～22 g，香港中文大学惠赠。5－Fu注射液，天津金耀氨基酸有限公司;B［a］P和NNK，购自Sigma公司;丙氨酸氨基转移酶(ALT)试剂盒、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)试剂盒、丙二醛(MDA)试剂盒、超氧化物歧化酶(SOD)试剂盒、尿素氮(BUN)试剂盒、血肌酐(Scr)试剂盒均购于南京建成生物工程研究所。

1.2 小鼠诱发性肺癌模型的建立 除正常对照组以外，其余各组A/J小鼠均以3 μmol苯并［a］芘(B［a］P)和 3 μmol甲基亚硝胺吡啶基丁酮(NNK)制成的混合诱导剂进行灌胃，每周1次，连续灌胃8周，诱发小鼠肺癌。

1.3 动物分组及给药 AJ小鼠50只，随机均分为5 组，正常组、模型组、5F 组(250 mg·kg－1)、5 －Fu组(25 mg·kg－1)和5F+5 －Fu组(5F 50 mg·kg－1+5－Fu 25 mg·kg－1)。从第9周开始，分别腹腔注射相应药物，模型组给予生理盐水，连续给药14周后处死小鼠。眼球眶静脉采血，取肺、肝、肾等脏器检测各项指标。

1.4 观察指标和方法

1.4.1 体重 实验期间每周称取小鼠体重。

1.4.2 肿瘤数量 取出肺脏，计算肺脏的肿瘤数量。

1.4.3 脏器系数 取肝脏和肾脏组织，称重，计算脏器系数，脏器系数 =脏器重量(g)/体重(g)×100。

1.4.4 肝肾功能 按照试剂盒说明书，检测血清中ALT、AST、BUN 和 Scr的变化。

1.4.5 SOD和MDA检测 按照试剂盒说明书，检测血清中SOD和MDA的变化。

1.5 统计学方法 采用SPSS 20.0统计软件，进行单因素方差分析与析因设计方差分析，两两比较用方差齐选用LSD检验，方差不齐选用Tamhane's T2检验。

2 结果

2.1 5F与5－Fu联合用药对NNK和B［a］P诱导A/J小鼠肺癌的影响 如图1所示，与正常组比较，模型组小鼠体重略有下降，而5F组、5－Fu组和(5F+5－Fu)组小鼠体重略有升高。与模型组比较，5F和5－Fu联合用药，或者分别单独给药均能降低小鼠肿瘤数量，差异有显著意义，其中(5F+5－Fu)组肿瘤抑制率最高，达44.36%。5F可以增强5－Fu的治疗效果，两者联合用药具有协同效应，结果见表1。

表1 5F和5－Fu联合应用对NNK和B［a］P诱导A/J小鼠肺癌的影响

图1 5F与5－Fu联合用药对诱发性肺癌小鼠体重的影响

2.2 5F和5－Fu联合应用对肺癌小鼠肝脏、肾脏系数和肝肾功能的影响 如表2所示，与模型组比较，各给药组肝脏和肾脏系数没有明显变化。血清ALT检测结果显示，5F不影响ALT水平，5－Fu组ALT水平升高，但5F与5－Fu联合应用可降低ALT水平，与5－Fu组比较差异有统计学意义。血清AST检测结果显示，模型组AST水平升高，5F组和(5F+5－Fu)组AST水平较模型组降低(P＜0.05或P＜0.01)。血清BUN和Scr检测结果各组之间没有显著差异，结果见表3。

表2 5F和5－Fu联合应用对肺癌小鼠脏器系数的影响

2.3 5F和5－Fu联合应用对肺癌小鼠血清SOD和MDA的影响 模型组SOD水平较正常组降低，5F和5－Fu联合或者分别单独给药均能提高SOD水平，与模型组比较有显著性差异。对血清MDA水平的检测结果显示各组无明显差别，结果见表4。

表3 5F和5－Fu联合应用对肺癌小鼠血清ALT、AST、BUN 和 Scr的影响

表4 5F和5－Fu联合应用对肺癌小鼠血清SOD和MDA的影响

3 讨论

在世界范围内，肺癌是所有恶性肿瘤中发病率和死亡率最高的肿瘤［3］。吸烟是肺癌公认的最主要的致病因素，B［a］P和NNK是香烟烟雾所含的主要致癌物质［4，5］。Hecht等［6，7］利用 B［a］P 和 NNK 为诱导剂建立的A/J小鼠肺癌模型，其肺癌形成的机制跟人类有很大相似性，是研究人类肺癌尤其是吸烟引起肺癌的首选模型。因此本研究利用更接近于人体肿瘤生长状态的A/J小鼠诱发性肺癌模型来探讨5F与5－Fu联合应用在体内的抗肿瘤活性。

5F是从生长在我国南方的传统中草药半边旗中分离得到的一种具有抗肿瘤活性的二萜类化合物［8］。前期的研究证实，在体外5F能抑制 NCIH460、NCI－H23、A549和 CRL－2066等肺癌细胞生长并诱导其凋亡，在体内5F显著降低NNK诱导的肺癌数量和大小，且对肝肾功能无明显毒副作用［9，10］。5－Fu 是临床常用的抗肿瘤药物，常用于治疗肺癌、肠癌、胃癌等多种癌症，因此，我们将5F与5－Fu合用，探讨两者联合应用的可行性。

我们的研究结果表明，5F和5－Fu联合用药可以显著降低B［a］P和 NNK诱导的A/J小鼠肺癌数量，肿瘤抑制率达44.36%，与单独使用5F或5－Fu相比，联合用药具有协同效应。对肝脏和肾脏系数，血清ALT、AST、BUN和Scr的检测显示，对肝肾功能没有明显毒副作用，而且能降低5－Fu导致的ALT和AST升高。此外，5F和5－Fu联合还显著提高SOD的水平。这些结果均提示，可以在临床上将5F与5－Fu联合应用治疗肺癌。然而，目前对于5F与5－Fu协同抗肺癌作用的机制尚不清楚。吸烟所诱发的肺癌会导致K－ras、NF－κB和 p53等基因的改变［11］，在这些分子中，已知5F的抗癌作用与调节NF－κB信号通路和影响p53基因有关，5F与5－Fu的协同效应是否与这些分子有关，有待进一步研究。

［1］支修益.我国肺癌流行病学现状分析［J］.中国处方药，2009，83(2):56 －57.

［2］Li MY，Leung J，Kong AY，et al.Anticancer efficacy of 5F in NNK－induced lung cancer development of A/J mice and human lung cancer cells［J］.J Mol Med(Berl)，2010，88(12):1265 －1276.

［3］Jemal A，Bray F，Center MM，et al.Global cancer statistics［J］.CA Cancer J Clin，2011，61(2):69 －90.

［4］Kishi S，Yokohira M，Yamakawa K，et al.Significance of the progesterone receptor and epidermal growth factor receptor，but not the estrogen receptor，in chemically induced lung carcinogenesis in female A/J mice［J］.Oncol Lett，2014，8(6):2379 －2386.

［5］Shanmugam R，Kusumanchi P，Appaiah H，et al.A water soluble parthenolide analog suppresses in vivo tumor growth of two tobacco－ associated cancers，lung and bladder cancer，by targeting NF － κB and generating reactive Oxygen species［J］.Int J Cancer，2011，128(10):2481 －2494.

［6］Hecht SS，Isaacs S，Trushin N.Lung tumor induction in A/J mice by the tobacco smoke carcinogens 4－(methylnitrosamino)－1－(3－pyridyl)－1－butanone and benzo［a］pyrene:a potentially useful model for evaluation of chemopreventive agents［J］.Carcinogenesis，1994，15(12):2721－2725.

［7］Johnson TE，Hermanson D，Wang Lei，et al.Lung tumorigenesis suppressing effects of a commercial kava extract and its selected compounds in A/J mice［J］.Am J Chin Med，2011，39(4):727 －742.

［8］叶华，龚先玲，李立，等.半边旗有效成份5F对腹膜炎小鼠血清NO和细胞因子的影响［J］.药学研究，2014，33(12):683－685.

［9］刘义，Chen George－g，吕应年，等.半边旗活性物质5F对非小细胞肺癌 NCI－ H460 细胞 Iκ Kβ、IκB、p65 及p50 mRNA 表达的影响［J］.中草药，2010，41(3):435－439.

［10］Li L，Chen GG，Lu YN，et al.Ent－11α －Hydroxy－15 －oxo－kaur－16－en－19－oic－acid inhibits growth of human lung cancer a549 cells by arresting cell cycle and triggering apoptosis［J］.Chin J Cancer Res，2012，24

(2):109－115.

［11］Tharappel JC，Cholewa J，Espandiari P，et al.Effects of cigarette smoke on the activation of oxidative stress－related transcription factors in female A/J mouse lung［J］.J Toxicol Environ Health A，2010，73(19):1288 －1297.