大黄鱼内脏肽的组成及理化性质的研究

李致瑜,张 翀,田玉庭,郑宝东

(福建农林大学 食品科学学院,福建福州 350002)

大黄鱼内脏肽的组成及理化性质的研究

李致瑜,张 翀,田玉庭,郑宝东*

(福建农林大学 食品科学学院,福建福州 350002)

目的:本文旨在研究大黄鱼内脏肽的基本化学组成和不同条件下的理化性质。方法:初步测定了大黄鱼内脏肽粉末中蛋白质、脂质、水分、灰分的含量,对低、中、高剂量(2%、5%、10%)的大黄鱼内脏肽溶液在不同pH条件下的相对溶解度、乳化性、乳化稳定性、起泡性和泡沫稳定性等理化特性进行研究,并分析了不同浓度下的大黄鱼内脏肽的粘度和抑制脂质过氧化活性。结果:大黄鱼内脏多肽中蛋白含量为88.42%,具有较好的溶解性和粘度,等电点约为pH6。在等电点附近时,乳化性和泡沫稳定性随着pH的升高呈先下降后上升的趋势,即在等电点附近时,乳化性和泡沫稳定性降至最低,而乳化稳定性和起泡性则随着pH的升高呈先上升后下降的趋势,当pH为等电点时达到最大。随着多肽浓度的升高,乳化稳定性、泡沫稳定性有一定的提高,而乳化性有所下降,起泡性则没有显著变化。另外大黄鱼内脏肽能有效抑制乳浊液的脂质过氧化。相对于传统乳化剂Tween 20,在150 min后,10%的大黄鱼内脏肽MDA值降低了84.5%,并能显著抑制油滴的絮凝。结论:大黄鱼内脏肽在不同的环境和浓度下表现出不同的理化性质,可作为一种潜在的多功能性食品添加剂。

大黄鱼内脏肽,化学组成,理化特性

大黄鱼(Pseudosciaenacrocea),又名石首鱼、黄瓜鱼、黄鱼等,广泛分布于我国东、南海及黄海北部,是我国重要的经济水产品[1]。由于大黄鱼味道鲜美、营养丰富,倍受各类消费者的喜爱。但随着大黄鱼产量快速增长,越来越多的副产品被认为是废弃物而丢弃,如内脏、鱼鳞等。这不仅造成资源的极大浪费,而且对自然环境也会产生一定程度的污染。研究表明:鱼类内脏含有丰富的蛋白质,如胶原蛋白、纤维蛋白等,因此可被认为是制备蛋白质及其相关产品的优质蛋白源[2]。

随着食品加工技术的进步,蛋白质在乳化剂、胶凝剂、起泡剂等材料上的应用逐渐受到越来越多学者的关注[3]。但在食品加工过程中,蛋白质容易受到热、光、辐射、高压等工艺的影响而变性,高级结构发生改变,导致功能性丧失。研究表明:通过酶解法制备活性肽能显著改善蛋白质理化性质,包括降低蛋白质的黏度、提高了蛋白质的柔性、疏水性等表面性质,并赋予了蛋白质某些生物活性,如抑菌性、抗氧化性等[4]。提高了其在食品工业中的应用价值。Lassoued等通过酶解海刺鱼皮提高胶原蛋白的起泡性[3],Kingsley等通过酶解面筋蛋白得到乳化性较强的蛋白肽[5]。

前期研究表明,通过Alcalase制备的大黄鱼内脏肽具有适中的水解度,DH%在2 h后稳定在10%左右,并且含有大量的疏水性氨基酸(-Phe-Trp)。这暗示了大黄鱼内脏肽可能具有较为丰富的功能性质。本文以大黄鱼内脏蛋白为研究对象,研究了蛋白肽的溶解性、黏度、乳化性、起泡性和抑制乳浊液中脂质过氧化等功能性质,探讨了大黄鱼内脏蛋白在溶解性、黏度、乳化性、起泡性不同条件下的规律性变化,以期为促进大黄鱼副产品的深加工提供一定的科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

大黄鱼内脏:由福建福鼎海鸥水产食品有限公司提供,包装于双层聚乙烯袋中置于-20 ℃冷冻备用。Alcalase 酶制剂(2.4 AU/g),诺维信公司。植物油:山东鲁花集团有限公司,盐酸、浓硫酸、氢氧化钠、磷酸、硫代巴比妥酸、三氯乙酸、异丙醇、石油醚、十二烷基硫酸钠、氯化亚铁等 均为国药分析纯。

绞肉机 永康市迪利工贸有限公司;PB-10 数显pH计 赛多利斯科学仪器(北京)有限公司;SHA-B水浴恒温振荡器 常州国华电器有限公司;H1850R 台式高速冷冻离心机 湖南湘仪实验室仪器开发有限公司;TU-1810DPC紫外可见分光光度计,北京普析通用仪器有限责任公司;NDJ-7粘度计 上海精密科学仪器有限公司;EYEL 4冷冻干燥机 日本东京理化仪器株式会社。

1.2 实验方法

1.2.1 大黄鱼内脏肽的制备工艺 大黄鱼内脏→解冻(25 ℃温水浸泡)→洗涤3～4次→除去性腺、鱼鳔、胆囊等→绞碎→异丙醇脱脂2～3次→灭酶(沸水浴10 min)→加水匀浆(10 g底物溶于100 mL蒸馏水中)→调节pH至9-加Alcalase碱性蛋白酶(2%)→酶解90 min→灭酶(沸水浴10 min)→离心(5000 r/min 20 min)→微滤(0.45 μm)→大孔树脂D392脱色(pH8.5、温度45 ℃、脱色时间:4 h)→超滤浓缩(3000 u)→浓缩液→冷冻干燥→大黄鱼内脏多肽粉

1.2.2 大黄鱼内脏肽的化学组成 将冻干后的大黄鱼内脏肽粉末进行化学成分测定。

水分的测定:GB.5009.3-2003常压直接干燥法

脂肪的测定:GB/T 5009.6-2003索氏抽提法

蛋白质的测定:GB.5009.5-2003微量凯氏定氮法

灰分的测定:GB.5009.4-2003高温灼烧法

1.2.3 相对溶解度的测定 根据Morris[6]的方法并做适当调整,配制25 mL 2%、5%和10%的大黄鱼内脏多肽,分别用0.5 mol/L的NaOH或HCl调节溶液pH分别为3～12,并在室温下离心(8000 g)20 min,取上清液。通过凯氏定氮法测定离心前后酶解液中的氮含量。

相对溶解度(%)=(A/B)×100

A:离心后上清液的氮含量,B:离心前酶解液的氮含量。

1.2.4 表观黏度的测定 表观黏度的测定参考姜莉的方法[7]:分别配制200 mL 0.1%、0.2%、0.5%、1%、3%、5%、10%、20%、30%的大黄鱼内脏多肽,用0.5 mol/L的HCl调节溶液pH至7,用NDJ-7型旋转黏度计测定其表观黏度。

1.2.5 乳化性和乳化稳定性的测定 在Pearce[8]的方法上略作修改,取30 mL 2%、5%和10%的大黄鱼内脏多肽,分别用0.5 mol/L的NaOH或HCl调节溶液pH分别为3～12,与10 mL的大豆油混合后在10000 r/min 的剪切速率下均质1 min,分别用移液枪在0 min和30 min从烧杯底部吸取200 μL的乳浊液,并用10 mL 0.1%的SDS稀释,测定稀释后溶液在500 nm的吸收波长。

乳化性(EAI，m2/g)=(2×2.303×A×B0)/(c×Φ×10000)

A:稀释倍数(50)；B0:放置0 min后乳浊液的吸光度；C:样品浓度(g/mL);Φ:油相体积分数(0.25)。

乳化稳定性(ESI，min)=B0×Δt/ΔB

Δt=60 min；ΔB=B0-B30；B30:放置30 min后乳浊液的吸光度。

1.2.6 抑制乳浊液脂质过氧化能力的测定 根据Rosswan[9]的方法并做适当调整,配制30 mL 2%、5%和10%的大黄鱼内脏多肽,分别用0.5 mol/L的NaOH或HCl调节溶液pH8,按上述方法配制乳浊液,并在30 ℃下避光保存,分别在5、10、20、30、60、90、150、180、210 min后取出,取0.5 mL样品并加入15 μL的50 nmol/L的FeCl2和10 mL硫代巴比妥酸溶液(0.375%硫代巴比妥酸、15%三氯乙酸和0.25 mol/L HCl),沸水浴加热15 min后冷却,在8000 g下离心20 min,最后在532 nm出测定其吸收波长,标准曲线采用丙二醛(2～10 ppm)代替上述的乳浊液。

1.2.7 起泡性和泡沫稳定性的测定 根据Agyare[10]的方法并做部分修改,将50 mL(V0)2%、5%和10%的大黄鱼内脏多肽,分别用0.5 mol/L的NaOH或HCl调节溶液pH分别为3～12,室温下磁力搅拌30 min放入高速分散仪高速搅打(1500 r/min)1 min,放置0 min和10 min后,将搅打好的100 mL的量筒中并读取泡沫的总体积。

起泡性(FC，mL)=V10-V0

泡沫稳定性(FS，%)=V10/V1×100%

表1 大黄鱼内脏肽基本成分含量(%)

V0:0 min后读取泡沫的总体积;V10:10 min后读取泡沫的总体积。

1.3 数据分析

每个实验重复三次,结果以“平均值±SD”表示。方差分析使用SPSS.17.0软件,采用Origin8.0作图。

2 结果与讨论

2.1 大黄鱼内脏肽化学组成分析

将试验样板放入容量1 L的气味瓶中密闭，然后放入80℃烘箱中恒温2 h。取出气味瓶冷却至室温，然后由5个评价人员进行气味等级评价，取出现次数最多的等级作为最终结果(可以取两个等级的中间值，如2.5级、3.5级)。

经过异丙醇脱脂、大孔树脂脱盐和膜浓缩后,大黄鱼内脏肽蛋白含量高达88.42%,说明前处理取得较好的效果,另外少量的脂肪和灰分可能会对大黄鱼内脏肽的理化性质造成一定的影响。

2.2 pH、多肽浓度对大黄鱼内脏肽相对溶解度的影响

图1 pH对大黄鱼内脏肽相对溶解性的影响Fig.1 Effect of different pH on solubility of Pseudosciaena crocea viscera peptide

2.3 多肽浓度对大黄鱼内脏肽粘度的影响

由图2可知,当多肽浓度为1%～5%时,多肽溶液粘度增长较慢,流动性较好。这是因为酶解使大黄鱼内脏蛋白分子量下降、极性基团增加,从而导致多肽溶解度上升,表观体积减小,表观黏度的下降。而多肽浓度大于5%时,酶解液随着浓度的增加而显著提升。当浓度为30%时,酶解液粘度为86 Pa·s,相比5%时提高了6倍。可能是当多肽浓度升高到一定范围时,其的分子链开始形成缔合,并伴随着极性基团水合作用的增强,从而增强溶液的黏度。

图2 多肽浓度对大黄鱼内脏肽粘度的影响Fig.2 Effect of different concentration on viscosity of Pseudosciaena crocea viscera peptide

2.4 多肽浓度对大黄鱼内脏肽抑制乳浊液脂质过氧化的测定

图3 多肽浓度对抑制油滴脂质过氧化的影响Fig.3 Effect of different peptide concentration on suppression of lipid peroxidation in oil

当乳浊液中引入一定量的Fe2+,可通过Fenton反应产生羟自由基对乳浊液表面的脂质造成一定的氧化损伤,而大多数乳化剂在维持乳浊液稳定的同时,也能不同程度的抑制乳浊液的脂质过氧化。大黄鱼内脏肽的抑制乳浊液的脂质过氧化能力见图3,2%、5%和10%的大黄鱼多肽都能有效抑制油滴的脂质过氧化,并且其活性显著高于Tween 20。当放置90 min时,2%、5%和10%大黄鱼多肽的抑制脂质过氧化活性是5%的Tween 20的2.22、2.96和3.69倍,并且随着时间的进一步增加,这种趋势愈加明显。这不仅由于大黄鱼内脏肽能够在油滴表面形成一层连续且致密的膜,从而降低分子氧或自由基的透过率[9],而且大黄鱼内脏肽本身具有一定的抗氧化活性,可通过抑制超氧阴离子自由基、螯合金属离子或是还原受损的脂质来降低油滴的脂质过氧化程度。然而,在90 min后,2%酶解液的MDA含量快速上升,并伴随着一定程度的絮凝,可能是由于界面上的多肽被过量氧化,导致构象的发生转变,从而降低了其在油-水界面的稳定性。而5%和10%的MDA含量仍处于较低水平,相比低浓度并未有显著上升趋势(p>0.05),然而随着时间的增加,也逐渐出现了不同程度的絮凝。因此大黄鱼内脏肽在抑制乳浊液脂质过氧化的能力存在一定的剂效关系。

由于蛋白在酶解后通常能改善分子内亲水与疏水之间的平衡,从而增强其在不同界面上的吸附能力[13]。不同浓度大黄鱼内脏肽的乳化性(EAI)和乳化稳定性(ESI)见图4、图5,当溶液处于等电点(pH6)时,大黄鱼内脏肽的乳化性最弱,这是由于多肽在等电点时的溶解性较差,分子向油水界面的扩散速率处于较低水平。另外,当溶液pH>9时,不同浓度的大黄鱼内脏肽乳化性逐渐呈一定的下降趋势。这可能因为过量的负离子残基降低了多肽与油相的相互作用,从而导致其在界面上的吸附量下降,引起乳化性的下降。多肽溶液的乳化性随多肽浓度升高而降低,在低浓度下,多肽向界面迁移的速率是受扩散控制的。然而在高浓度情况下,受活化能垒的影响,扩散速率降低,因此酶解液的乳化性随着多肽浓度的提高呈较大幅度的下降[5]。

图4 pH对不同多肽浓度的大黄鱼内脏肽乳化性的影响Fig.4 Emulsifying activity of Pseudosciaena crocea viscera peptide with different peptide concentration as influenced by pH

图5 pH对不同多肽浓度的大黄鱼内脏肽乳化稳定性的影响Fig.5 Emulsion stability of Pseudosciaena crocea viscera peptide with different peptide concentration as influenced by pH

多肽溶液的乳化稳定性是指吸附在油水界面的肽通过重排、相互作用等形成一层膜状结构来降低界面力,并抑制油滴絮凝、聚集的能力[14]。大黄鱼多肽的乳化稳定性随着pH增加呈先升高后降低的趋势,当溶液的pH为6时,乳化稳定性最强,这可能由于在pH6环境中,大黄鱼内脏肽在油-水界面上的空间结构发生有利的转变,形成稳定且坚固的保护膜,从而有效的抑制油滴聚集。当pH3和pH12时,乳化稳定性降至最低水平,其值仅为pH6时的40%。这可能是由于静电排斥的增加影响多肽分子间与分子内的相互作用,不利于其在界面上形成稳定的排列机制,降低了多肽在油水界面层的密度,导致其乳化稳定性的下降[15]。另外与乳化性相反,乳化稳定性溶液中多肽浓度的升高而有一定程度上升(p>0.05),相比2%的大黄鱼内脏肽,5%和10%的乳化稳定性平均提高了23.18%和31.56%。由于多肽浓度的上升,使多肽在界面的吸附量也有一定程度的增加,可能通过形成致密的网状结构,增强了油滴表面的黏弹性[8],从而增强了多肽乳化稳定性。另外,过量的多肽也可能增加了界面膜外的层数[5],对其乳化稳定性也有一定的积极作用性。

2.6 pH、多肽浓度对大黄鱼内脏肽起泡性与泡沫稳定性的影响

起泡性取决于多肽的溶解性、表面疏水性、分子量、净电荷量及分子的柔性等。良好的起泡性需要多肽能迅速扩散、吸附至气-液界面并形成一层坚固的膜结构[16]。大黄鱼内脏肽的起泡性和起泡稳定性如图6、图7所示,随着pH的上升起泡性呈先上升后下降趋势,当pH达到6时,起泡性达到最高,此时大黄鱼内脏多肽处于等电点,分子的静电排斥作用减弱,提高了肽与界面的亲和力,导致吸附至界面的多肽数量增加,并且有利于其在相界面上的相互作用,从而提高了膜的表面粘度,因此多肽的起泡性较好[5]。当pH<4或pH>11时,大黄鱼内脏肽分子的净电荷量较高、排斥效果较为明显,不利于其致密、稳定地排列在界面上。多肽浓度对起泡性的影响不显著,2%、5%和10%的大黄鱼内脏肽之间的起泡性并没有显著差异(p>0.05)，这可能由于其在气-液界面的吸附量已接近饱和[16]。

图6 pH对不同多肽浓度的大黄鱼内脏肽起泡性的影响Fig.6 Foaming capacity of Pseudosciaena crocea viscera peptide with different peptide concentration as influenced by pH

图7 pH对不同多肽浓度的大黄鱼内脏肽泡沫稳定性的影响Fig.7 Foaming stability of Pseudosciaena crocea viscera peptide with different peptide concentration as influenced by pH

泡沫稳定性是指适当地调节多肽在水相与气-液界面的比例,抑制泡沫排液、破裂和不同程度的相分离现象[15]。酶解法降低了蛋白的分子量,提高了多肽分子的柔性,有利于其在相界面通过适当的构象转变形成稳定的吸附,提高泡沫的稳定性。随着pH的上升,泡沫稳定性呈先下降后上升的趋势,当pH为12时,泡沫稳定性最高,在10 min后仍然有75%的泡沫处于稳定状态。当pH远离等电点时,吸附界面的多肽提高了液膜表面的电荷,有利于液膜间保持一定的间距,抑制了泡沫之间的聚集,稳定了分散相中泡沫的结构[17]。另外,泡沫稳定性随多肽浓度提高呈一定增长趋势。相对2%的大黄鱼多肽,5%的多肽溶液泡沫稳定性明显提高,这是由于随着多肽浓度的上升通过增强溶液的表观粘度和泡沫的Gibbs-Marangoni效应,从而提高了液膜的强度和稳定性[18]。而5%和10%的大黄鱼内脏肽的泡沫稳定性并没有显著差异,可能是过量的多肽导致气-液界面极性增强,一定程度促进了泡沫之间的相互作用,不利于分散相保持稳定[19]。

3 结论

本实验制备的大黄鱼内脏多肽蛋白含量约为88.42%,等电点在pH6附近。随着pH的升高,乳化性和泡沫稳定性先下降后上升,而乳化稳定性和起泡性则呈先下降后上升的趋势。溶解性、乳化性和泡沫稳定性在pH6时最小,而乳化稳定性和起泡性在等电点附近时达到最大,这与分散相的特点和多肽的性质有关。此外,样品中少量的盐离子、脂肪可能会对结果产生一定影响。

随着溶液中多肽浓度的上升,溶液黏度、乳化稳定性、泡沫稳定性有不同程度的提高,而溶解性、乳化性则有所下降。另外,大黄鱼内脏多肽能显著抑制乳浊液的脂质过氧化,并呈一定的量效关系。

以上结论表明:大黄鱼内脏肽在不同的环境和浓度表现出不同的理化性质(乳化性、起泡性,抑制乳浊液脂质过氧化)。根据食品质地、风味、营养性质的差异,选择合适的多肽浓度可提高食品在加工、贮藏过程中的稳定性。因此,大黄鱼内脏肽可作为一种潜在的多功能性食品添加剂。另外,酶解制备功能性肽为大黄鱼产业中副产品的综合利用开辟了一条新途径。

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Composition and physicochemical properties ofPseudosciaenaCroceaviscera peptide

LI Zhi-yu,ZHANG Chong,TIAN Yu-ting,ZHENG Bao-dong*

(College of Food Science,Fujian Agriculture and Forest University,Fuzhou 350002,China)

Objective:To study and discuss the essential chemical composition and physicochemical properties ofPseudosciaenacroceaviscera peptide. Methods:The content of protein,fat,moisture and ash inPseudosciaenacroceaviscera peptide powder were measured. The physicochemical properties of different peptides concentration(2%,5%,10%),were evaluated under different pH conditions. Besides,viscosity and inhibition of lipid peroxidation in emulsion were also discussed with different peptides concentration. Results:The results indicated thatPseudosciaenacroceaviscera peptide contained 88.42% of protein and the pI was about pH6,at which emulsibility and foam stability reached the lowest and then had a rapid improvement. However,emulsion stability,foamability were increased firstly with the increasing of pH and then decreased,which met the bottom at pH6. The increase of peptide concentration possessed higher viscosity,emulsion stability and foam stability. On the contrary,the solubility,emulsibility got significant reduction while peptide concentration increased. In addition,foam stability did not have a significant changed as peptide concentration increased. Moreover,Compared with traditional emulsifier Tween 20,10%Pseudosciaenacroceaviscera peptide were not only decreased MDA in emulsifier about 84.5% after 150 min,but also showed inhibition of flocculation. Conclusion:Pseudosciaenacroceaviscera peptide exhibited diverse physicochemical properties under different pH or concentration conditions,and could be used as potential additives for food applications

Pseudosciaenacroceaviscera peptide;chemical composition;physicochemical properties

2014-12-15

李致瑜(1991-)，男，硕士研究生，主要从事食品加工与贮藏研究，E-mail:ck1272389116@163.com。

*通讯作者:郑宝东(1967-)，男，博士，教授，主要从事食品加工与贮藏研究,E-mail:zbdfst@163.com。

福建省海洋高新产业发展专项项目(2013007)。

TS254.1

A

1002-0306(2015)21-0093-06

10.13386/j.issn1002-0306.2015.21.010