β-1,3-1,4葡聚糖酶在大肠杆菌中的高效分泌表达

陈珊珊,吴珊珊,吴 斌,何冰芳

(南京工业大学药学院,江苏南京 211816)

β-1,3-1,4葡聚糖酶在大肠杆菌中的高效分泌表达

陈珊珊,吴珊珊,吴 斌,何冰芳*

(南京工业大学药学院,江苏南京 211816)

在大肠杆菌中实现β-1,3-1,4-葡聚糖酶的高效分泌表达。将实验室自主开发的信号肽ff53与β-1,3-1,4-葡聚糖酶成熟肽基因(bgl)进行融合连接到pET-28a(+)上;通过优化诱导表达条件,28 ℃、8 g/L乳糖诱导10 h,重组菌E.coliBL21/pET-ff53-bgl发酵液上清中β-1,3-1,4-葡聚糖酶活力达到1093 U/mL,与IPTG诱导的重组菌E.coliBL21/pET-bgl(583 U/mL)相比,提高了0.87倍。本研究为高密度发酵制备该酶奠定了基础。

信号肽ff53,β-1,3-1,4葡聚糖酶,分泌表达,大肠杆菌

β-1,3-1,4-葡聚糖酶(EC3.2.1.73)(BGL)是一种重要的工业用酶,主要来源于植物和微生物,能够高效、专一分解禾本植物胚乳细胞壁中的β-葡聚糖,因而广泛应用于啤酒酿造业和饲料业[1-2]。在啤酒酿造过程中,β-1,3-1,4-葡聚糖酶能有效提高糖化得率[3],可降低麦汁粘度,改善啤酒风味,保持成品酒稳定性[4]。在饲料中添加这类酶可显著降低谷物中所含β-葡聚糖的聚合度,改善谷物营养价值,增加饲料利用率[5-6]。除此之外,β-1,3-1,4-葡聚糖酶可以降解真菌的细胞壁,显示抗真菌和植物病原菌的活性[7-8]。目前国内外己克隆和表达了多种不同来源的β-1,3-1,4-葡聚糖酶基因,包括枯草芽孢杆菌[9-10]、地衣芽孢杆菌[11]、热纤维杆菌[12]和牛链球菌[13]等。目前β-1,3-1,4-葡聚糖酶在大肠杆菌中多为胞内表达,胞内表达较好的酶活为1286 U/mL[11]。仅有少量研究实现了分泌表达,Mao[14]等通过将β-1,3-1,4-葡聚糖酶基因克隆至pET-32a(+)中,在大肠杆菌中实现了分泌表达,胞外酶活为102.7 U/mL。作为酿造与饲料用酶,胞外表达可以极大简化下游复性及分离纯化,同时可减少表达蛋白对宿主菌的毒性和代谢负担,显著提高表达量。

本课题组前期从B.subtilisLC-9 中得到一种高活性的β-1,3-1,4-葡聚糖酶,并实现了其在大肠杆菌BL21(DE3)中的胞内表达[15]。为了进一步扩宽β-1,3-1,4-葡聚糖酶的实际应用,简化其后续分离制备工艺,本研究将实验室自主开发的信号肽ff53[16]与β-1,3-1,4-葡聚糖酶的成熟肽基因(bgl)融合,在大肠杆菌中实现了β-1,3-1,4-葡聚糖酶的高效分泌表达,为高密度发酵制备β-1,3-1,4-葡聚糖酶奠定了基础。

表1 实验中所用的引物序列

注:下划线为NcoⅠ和XhoⅠ酶切位点。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 菌株和质粒 枯草芽孢杆菌BacillussubtilisLC-9(CCTCCM208073)、大肠杆菌E.coliBL21(DE3)、E.coliBL21/pET-bgl和表达载体pET-28a(+)实验室保存。

1.1.2 培养基 LB培养基(g/L):氯化钠10,蛋白胨10,酵母粉5。固体培养基中加入2%琼脂。抗性培养基加入卡那霉素(50 μg/mL)。

1.1.3 酶和试剂 DNA限制性内切酶NcoⅠ和XhoⅠ、T4 DNA Ligase、胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒、PCR纯化试剂盒、蛋白质分子量标准和DNA分子量标准 宝生物工程(大连)有限公司;2×Taq PCR Master Mix和Pfu DNA Polymerase 北京庄盟国际生物基因科技有限公司;异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)和卡那霉素 Sigma公司;乳糖 西陇化工股份有限公司;1-3,1-4-beta-D-Glucan和大麦β-葡聚糖 Megazyme公司;引物合成及测序 苏州金唯智公司。

1.1.4 实验仪器 酶标仪 美国BIO-TECH;PCR仪 德国Eppendorf;凝胶成像系统 英国UVItec Cambrige;垂直电泳仪 美国Biorad;超净台工作室 苏州净化设备厂;紫外分光光度计 上海精密科学仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 β-1,3-1,4-葡聚糖酶基因的克隆表达 参照文献[15]的方法。

1.2.2 信号肽ff53融合β-1,3-1,4-葡聚糖酶的克隆表达。

1.2.2.1 表达引物的设计 根据信号肽ff53和β-1,3-1,4-葡聚糖酶的成熟肽基因序列,设计over-lap扩增策略的部分重叠引物,引物序列如表1所示。

1.2.2.2 Over-lap PCR 第一轮PCR:以ff53-F和ff53-bgl-Rm为引物扩增上游信号肽ff53;以ff53-bgl-Fm和bgl-R扩增β-1,3-1,4-葡聚糖酶的成熟肽bgl;第二轮PCR:以第一轮产物ff53和bgl为模板进行延伸,获得融合基因片段;第三轮PCR:以ff53-F和bgl-R为引物,以融合基因片段为模板,进行扩增获得融合基因ff53-bgl[17]。

1.2.2.3 重组质粒pET-ff53-bgl的构建 pET-28a(+)是受强噬菌体T7转录及翻译信号控制的高效表达载体。PCR产物经纯化后用限制性内切酶NcoⅠ和XhoⅠ双酶切,同时以相同的限制性内切酶酶切pET-28a(+)。将酶切产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳,回收双酶切的融合基因和载体,T4 DNA Ligase连接,16 ℃连接过夜,连接产物转化E.coliBL21(DE3)细胞中,涂布于含50 μg/mL卡那霉素的LB平板,37 ℃过夜培养后。菌落PCR鉴定阳性重组子,挑选阳性重组子提取质粒用NcoⅠ和XhoⅠ进行双酶切验证同时进行测序验证。

1.2.3 重组菌的诱导表达

1.2.3.1 IPTG诱导 将重组菌接种至含50 μg/mL卡那霉素的LB液体培养基,37 ℃,180 r/min培养过夜后,按2%接种量接种至新鲜LB培养基中(50 μg/mL卡那霉素),37 ℃,180 r/min培养OD600为0.6～0.9时,参照文献[11]的方法,加入终浓度为1 mmol/L的IPTG进行诱导,28 ℃诱导表达10 h。

取1 mL诱导表达的菌液于1.5 mL离心管,12000 r/min离心1 min。收集上清,另外用1 mL ddH2O重悬菌体,12000 r/min离心1 min,彻底除去上清,再用1 mL ddH2O重悬菌体。菌体于冰浴中超声破碎至澄清,12000 r/min离心1 min,收集上清。

1.2.3.2 乳糖诱导 按方法1.2.3.1所述,分别加入终浓度为0.5、2、4、6、8、10 g/L的乳糖进行诱导,28 ℃诱导表达10 h。

1.2.4 表达产物SDS-PAGE电泳 取方法1.2.3中的发酵液上清和细胞破碎上清进行分析。采用12.5%的分离胶和4%的浓缩胶的SDS-PAGE,发酵液上清和细胞破碎上清加入4×上样缓冲液,沸水浴5 min后上样15 μL,电泳后使用考马斯亮蓝R-250进行染色[18]。

1.2.5 糖苷酶活力测定 采用二硝基水杨酸(DNS)法测定糖苷酶活力[19]:以1%(W/V)1-3,1-4-beta-D-Glucan 1 mL作为底物,加入0.5 mL适当稀释的酶液,45 ℃反应10 min后,立即加入3.0 mL DNS溶液终止反应,沸水浴5 min显色,冷却后测540 nm下反应液的吸光值,以灭活的酶液作为空白对照。酶活力单位(U)定义:每分钟由底物产生1 μmol还原糖所需的酶量定义为一个活力单位。

1.2.6 β-1,3-1,4-葡聚糖酶的酶学性质 参照文献[4]的方法,考察pH和温度对胞外分泌的重组β-1,3-1,4-葡聚糖酶活力的影响,研究该酶的温度和pH稳定性。

2 结果与分析

2.1 信号肽ff53与bgl基因的融合

为了实现信号肽ff53与bgl基因的融合,按方法1.2.2所述进行扩增。扩增的产物经凝胶电泳(图1a),上游序列ff53在150 bp左右有一条带,下游序列bgl在650 bp左右有一条带,与预计大小(上游159 bp,下游642 bp)一致。重叠后的PCR产物在800 bp左右出现一条条带,与预计融合基因ff53-bgl条带大小(801bp)基本符合(图1b),这表明成功实现了信号肽ff53与bgl基因的融合。

图1 PCR扩增产物电泳图谱Fig.1 Electrophoresis analysis of PCR product注:a:M:DL2000 DNA分子量标准;1:ff53;2:bgl;b:M:DL2000 DNA分子量标准;1:融合基因ff53-bgl

2.2 重组质粒pET-ff53-bgl的构建

PCR产物ff53-bgl和pET-28a(+)分别经NcoⅠ和XhoⅠ双酶切,经T4 DNA Ligase连接获得重组质粒pET-ff53-bgl,其构建过程如图2。

图2 重组质粒pET-ff53-bgl构建图Fig.2 Construction of recombinant plasmid pET-ff53-bgl

对重组质粒pET-ff53-bgl进行NcoⅠ和XhoⅠ双酶切验证,琼脂糖凝胶电泳在约800 bp和5000 bp处出现条带(图3),与目的基因和pET-28a(+)的片段大小一致。测序结果表明克隆的序列与理论序列一致,表明成功构建了重组质粒pET-ff53-bgl。同时构建了不带信号肽的重组质粒pET-bgl作为对照。

图3 重组质粒pET-ff53-bgl经NcoⅠ和XhoⅠ双酶切验证图Fig.3 Idenfication of recombinant plasmid pET-ff53-bgl double digested by NcoⅠand XhoⅠ注:1:DL15000 DNA分子量标准;2:DL2000 DNA分子量标准;3:ff53-bgl/NcoⅠ-XhoⅠ;4:pET-ff53-bgl/NcoⅠ-XhoⅠ;5:pET-28a(+)/NcoⅠ-XhoⅠ。

2.3 重组菌的诱导表达

2.3.1 重组菌E.coliBL21/pET-ff53-bgl的分泌表达 按方法1.2.3.1所述进行诱导,以酶活力及SDS-PAGE电泳考察胞外分泌表达情况,结果如图4,重组菌E.coliBL21/pET-bgl诱导表达10 h后的发酵液上清几乎无酶活,重组细胞的破碎上清酶活力达到583 U/mL(见第3泳道),经SDS-PAGE电泳在28 ku左右有一条明显的蛋白条带,这与β-1,3-1,4-葡聚糖酶理论分子量28 ku一致。重组菌E.coliBL21/pET-ff53-bgl发酵液上清酶活达到562 U/mL(见第4泳道),在28 ku左右出现明显的蛋白条带,与不带信号肽的β-1,3-1,4-葡聚糖酶大小一致,表明信号肽ff53已被切除。重组菌E.coliBL21/pET-ff53-bgl总酶活(菌体OD 1.9)达到860 U/mL,总酶活是未加信号肽ff53的重组菌E.coliBL21/pET-bgl(菌体OD 2.1)的1.48倍。酶活力测定和SDS-PAGE结果显示融合信号肽ff53的β-1,3-1,4-葡聚糖酶在大肠杆菌中不仅实现了高效的分泌表达,还增加了总酶活力。

图4 IPTG诱导重组菌的SDS-PAGE(a)及酶活力图(b)Fig.4 SDS-PAGE(a)and enzyme activity(b) of recombined strain induced by IPTG注:M:蛋白分子量标准;泳道1:对照E.coli BL21/pET-28a(+);泳道2:E.coli BL21/pET-bgl发酵液上清;泳道3:E.coli BL21/pET-bgl细胞破碎上清;泳道4:E.coli BL21/pET-ff53-bgl发酵液上清;泳道5:E.coli BL21/pET-ff53-bgl细胞破碎上清。

2.3.2 重组菌E.coliBL21/pET-ff53-bgl分泌表达的优化 乳糖除了能作为lac操纵子的诱导剂外,本身也是一种碳源可以被菌体代谢利用,通过提高菌体量从而产生更多的目标蛋白。按方法1.2.3.2所述用乳糖进行诱导,结果如图5,在一定范围内,乳糖终浓度愈高,目的蛋白的表达量也愈高。当乳糖终浓度为8 g/L时,重组菌E.coliBL21/pET-ff53-bgl发酵液上清酶活达到最高,为1093 U/mL,与用IPTG诱导的重组菌相比,发酵液上清酶活力提高了0.87倍。此后随着乳糖浓度的增加,目的蛋白的表达量不再增加并且略有下降。用乳糖代替IPTG作为诱导剂,不仅可以节约生产成本,而且还提高了重组菌发酵液上清中β-1,3-1,4-葡聚糖酶活力。

图5 乳糖诱导重组菌SDS-PAGE(a)及酶活图(b)Fig.5 SDS-PAGE(a)and enzyme activity(b) of recombined strain induced by lactose注:M:蛋白分子量标准;泳道1-6:E.coli BL21/pET-ff53-bgl分别在乳糖终浓度为0.5、2、4、6、8、10 g/L条件下诱导时的发酵液上清。

2.4 β-1,3-1,4-葡聚糖酶的酶学性质研究

胞外分泌的重组β-1,3-1,4-葡聚糖酶最适反应pH和温度分别为6.5和45 ℃,且在pH6.5 和45 ℃下稳定;该性质与野生菌BacillussubtilisLC-9产生的原始酶一致[4]。

3 结论

β-1,3-1,4-葡聚糖酶作为一种重要的工业用酶,其应用已经扩展到饲料工业、酿酒工业、医药纺织等各个领域中,具有广阔的应用前景[20]。β-1,3-1,4-葡聚糖酶在大肠杆菌中多为胞内表达,仅有少量研究实现了分泌表达。本研究采用over-lap PCR将本实验室自主开发的信号肽ff53与β-1,3-1,4-葡聚糖酶成熟肽基因(bgl)进行融合,成功实现了β-1,3-1,4-葡聚糖酶在大肠杆菌表达系统的高效分泌表达。通过优化诱导表达条件,28 ℃、8 g/L乳糖条件下诱导10 h,重组菌E.coliBL21/pET-ff53-bgl发酵液上清中β-1,3-1,4-葡聚糖酶活力达到1093 U/mL,与IPTG诱导的重组菌E.coliBL21/pET-bgl(583 U/mL)相比,提高了0.87倍;并且发酵液上清中目的蛋白占总蛋白的80%以上,有利于目的蛋白的分离纯化。胞外分泌的重组β-1,3-1,4-葡聚糖酶最适反应pH和温度分别为6.5和45 ℃,且在pH6.5和45 ℃下稳定。β-1,3-1,4-葡聚糖酶的大肠杆菌胞外高效分泌为进一步高密度发酵制备该酶奠定了基础。

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Efficient secretory expression of β-1,3-1,4-glucanase inE.coli

CHEN Shan-shan,WU Shan-shan,WU Bin,HE Bing-fang*

(College of Pharmaceutical Sciences,Nanjing Tech University,Nanjing 211816,China)

In this study,the highly secretory expression of β-1,3-1,4-glucanase was achieved inE.coli. Signal peptide ff53 developed by our team was fused with mature peptide gene(bgl)of β-1,3-1,4-glucanase,then cloned into the pET-28a(+)plasmid. Efficient extracellular expression was obtained under following optimized conditions:8g/L lactose at 28 ℃ for 10 h,resulting in the enzyme activity ofE.coliBL21/pET-ff53-bglin culture medium reached 1093 U/mL,which increased 0.87 folds compared with enzyme activity ofE.coliBL21/pET-bgl(583 U/mL)induced with IPTG. The study laid the foundation of high density fermentation of β-1,3-1,4-glucanase production.

signal peptide ff53;β-1,3-1,4-glucanase;secretory expression;E.coli

2015-03-10

陈珊珊(1989-)，女，硕士研究生，研究方向：分子生物学,E-mail:starrygirl@126.com。

*通讯作者:何冰芳(1962-)，女，博士，教授，研究方向：微生物学、分子生物学,E-mail:bingfanghe@njtech.edu.cn。

国家973计划(2011CBA00807)；国家973计划(2011CB707400)。

TS201.3

A

1002-0306(2015)21-0139-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.21.020