甘蔗渣、啤酒糟培养灵芝研究和成分分析

黄清铧,王庆福,高裕锋,李奇伟,李锦荣,孟 飞,梁 磊,*

(1.广州甘蔗糖业研究所,广东广州 510316;2.广东省植物纤维综合利用工程技术研究开发中心,广东广州 510316;3.广州市植物纤维综合利用重点实验室,广东广州 510316)

甘蔗渣、啤酒糟培养灵芝研究和成分分析

黄清铧1,2,3,王庆福1,2,3,高裕锋1,李奇伟1,2,3,李锦荣1,2,3,孟 飞1,2,3,梁 磊1,2,3,*

(1.广州甘蔗糖业研究所,广东广州 510316;2.广东省植物纤维综合利用工程技术研究开发中心,广东广州 510316;3.广州市植物纤维综合利用重点实验室,广东广州 510316)

通过研究4个供试灵芝菌株生长速度、爬壁能力、菌丝密度和气生菌丝量等性状,筛选出最佳的灵芝母种培养基配方为马铃薯200 g,葡萄糖20 g,琼脂20 g,蔗渣粉20 g,蛋白胨3 g,磷酸二氢钾3 g,硫酸镁1.5 g,维生素B20.1 g;通过比较4个菌株在不同栽培基质上子实体干重、子实体厚度和子实体直径筛选到最适灵芝栽培配方为甘蔗渣82%、啤酒糟15%、石灰粉2%、糖1%;椴木栽培灵芝和蔗渣栽培的灵芝之间总三萜含量差异不大,其中4个供试灵芝总三萜含量均高于10 mg/g;实验结果显示蔗渣栽培的灵芝子实体中多糖含量是椴木栽培灵芝的两倍以上;重金属检测结果显示蔗渣栽培灵芝主要重金属元素含量低于椴木灵芝,但微量元素Mg、Zn、Se等含量较高,其中有机硒含量为0.189 mg/g。

甘蔗渣,啤酒糟,灵芝,重金属

灵芝又名灵芝草、万年蕈等,属多孔菌科,灵芝属,是我国最著名的药食两用真菌,因其具有增强人体免疫力[1],调节血糖血压[2],抗肿瘤[3]和保肝护肝[4]等多方面的治疗作用,被世人所青睐。目前研究发现的灵芝有效成分包括三萜类化合物、多糖类、腺苷以及其他一些生物碱化合物。

甘蔗渣为甘蔗压榨机械提汁后的主要产物,是制糖工业的主要副产品。甘蔗渣含有丰富的营养物质,其中,纤维素为 32%～48%、半纤维素 19%～24%、木质素23%～32%[5]。甘蔗渣来源集中,产量大,是一种再生性农林生物质资源,目前已在杏鲍菇[6]、平菇[7]和金针菇[8]等食药用菌的生产中得到广泛应用,但应用蔗渣栽培灵芝还鲜有报道,以甘蔗渣栽培灵芝可解决传统灵芝栽培过程中菌林矛盾等问题。啤酒糟是啤酒厂的副产物,粗蛋白含量达到25.7%[9],营养物质丰富,而且相比麸皮、玉米粉等传统有机氮源,成本更低,是一种优质的有机氮源,如果直接废弃,不仅污染环境,也造成巨大浪费。

因此,本实验以甘蔗渣为主要实验原料,进行灵芝母种培养基筛选,以甘蔗渣为碳源,啤酒糟为氮源,筛选适合灵芝栽培的培养基,并比较分析了不同灵芝总三萜类含量的差异和不同培养基栽培的灵芝子实体重金属含量,筛选出能够高效转化利用甘蔗渣、啤酒糟等废弃生物质原料的灵芝菌种和培养料配方,促进甘蔗渣的高值化利用及灵芝食品、保健食品开发。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

GL0002、GL0003 本实验室保藏菌种,GL0057、GL0102 福建农林大学菌物研究中心提供;安徽椴木灵芝子实体 赤芝,购于大别山产区;椴木栽培灵芝 赤芝,福建漳州菇农,GL0003;福建野生灵芝子实体 赤芝,漳州;广东椴木灵芝子实体 赤芝,翁源;齐墩果酸准品,香草醛,冰醋酸,高氯酸,乙醇,甲醇,石灰。

AA-300原子吸收分光光度计 美国铂金埃尔默公司;UV-2550 紫外可见分光光度计 日本岛津;XH-300UL 电脑微波超声波紫外光组合催化合成仪 北京祥鹄科技发展有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 母种培养基筛选 四种培养基编号为CK(对照组)、①、②、③,具体配方如下所示:CK 马铃薯200 g,葡萄糖20 g,琼脂20 g;①马铃薯200 g,葡萄糖20 g,琼脂20 g,蛋白胨3.0 g,磷酸二氢钾3.0 g,硫酸镁1.5 g,维生素B20.1 g;②马铃薯200 g,葡萄糖20 g,琼脂20 g,甘蔗粉20 g,蛋白胨3 g,磷酸二氢钾3 g,硫酸镁1.5 g,维生素B20.1 g;③马铃薯200 g,葡萄糖20 g,琼脂20 g,甘蔗粉20 g;加水定容至1 L。每个配方重复5次,于28 ℃下培养,每隔1 d生长划线并观察生长情况,待生长最快菌株长满管后,拍照并统计实验结果。

1.2.2 栽培培养基配方优化 以蔗渣为主要碳源,工业废弃物啤酒糟为主要氮源,设计培养基配方如下,编号分别为④、⑤、⑥,具体配方如下:④甘蔗渣82%,啤酒糟15%,石灰粉2%,糖1%;⑤甘蔗渣87%,啤酒糟10%,糖1%,石灰粉2%;⑥甘蔗渣77%,啤酒糟20%,糖1%,石灰粉2%;控制含水量在65%,每袋干料在330 g,每个配方接种5个重复,接种量5%,于25～28 ℃暗培养,保持空气湿度50%～65%;待长满袋后转入栽培室,湿度控制在70%～80%,温度控制在25～28 ℃,二氧化碳浓度为800 ppm左右;待长出小菇蕾,控制湿度75%～85%,加大通风量,控制二氧化碳浓度为500～600 ppm;待子实体边沿生长点消失,开始弹射孢子则关闭通风和加湿设备,待弹完孢子后采收并收集实验数据和实验原料。

1.2.3 灵芝有效成分差异性研究 总三萜含量测定:以1.2.2实验筛选到的最佳栽培配方所得的灵芝子实体粉碎、过40目筛为实验原料,灵芝子实体总三萜提取方法参照姚松君等[10]的超声波辅助提取法有改动,具体工艺参数是超声功率为500 W,乙醇浓度为75%,超声时间为20 min,料液比为1∶40,提取温度为70 ℃,提取液经过滤,旋转蒸发仪蒸干后用甲醇溶解,过滤并定容到50 mL;灵芝总三萜测定方法参照广东省地方标准DB44/T496-2008[11],以齐墩果酸为对照标准品,测定各组灵芝样品提取物在545 nm处吸光度。灵芝子实体多糖提取与测定方法参照《中国药典》[12]。

1.2.4 灵芝微量元素与重金属含量测定 选取GL0003蔗渣栽培和椴木栽培灵芝(于福建漳州栽培)子实体、广东灵芝、福建野生灵芝和安徽椴木灵芝粉碎,过40目筛,检测方法参照陈红香等[14]的方法。

2 结果与分析

2.1 灵芝母种培养基筛选

本实验通过生长速度、菌丝体浓密度、菌丝爬壁能力和气生菌丝量这四个指标筛选出最适灵芝生长的培养基配方,结果见表1,4个供试菌株在③号培养基上,其生长速度除了菌株GL0002明显被抑制之外其他3个菌株的生长速度与对照没有明显差别;但4个菌株的菌丝浓密度、爬壁能力和气生菌丝量均比对照组弱。配方①是在PDA培养基的基础上添加了蛋白胨、无机盐和VB2,结果显示:4个不同灵芝菌株在配方②培养基上生长,其长势即菌丝浓密度、爬壁能力和气生菌丝量均优于对照组,在生长速度上菌株GL0102跟GL0003明显优于对照,该配方对GL0002和GL0057则具有一定的抑制作用。配方②是结合配方①与配方③,即在添加蛋白胨、无机盐和VB2的基础上再添加甘蔗渣粉,结果表明4个不同灵芝菌株在配方②上的生长速度与长势均明显优于对照组和另外两个配方。说明在PDA培养基基础上只添加甘蔗渣粉对菌丝生长速度没有显著性差异,但会影响菌丝的长势;而添加蛋白胨、无机盐和VB2则会明显提高菌丝的长势,对生长速度的影响结果表现不一;同时添加甘蔗渣粉、蛋白胨、无机盐和VB2,在生长速度与长势上均具有显著性优势,可用于灵芝菌种的保藏与复壮。

2.2 栽培料配方对灵芝产量的影响

从图2实验结果可见,4个灵芝菌株均在配方④上产量最高,菌株GL0003在子实体干重,直径和厚度上均是配方④>配方⑤>配方⑥,统计结果显示配方④的子实体干重显著高于配方⑥,与配方⑤没有显著性的差异,其子实体直径统计结果表现出一样的趋势,子实体厚度上配方④则显著优于配方⑤和配方⑥;菌株GL0102在子实体干重与厚度上是配方④>配方⑥>配方⑤,其子实体直径统计结果与菌株GL0003一致;菌株GL0002在子实体干重、直径与厚度上同样表现出与菌株GL0003一样的趋势;菌株GL0057子实体干重在三个配方上没有显著差异,三个配方在子实体直径与厚度上的趋势与其他三个菌株略有差异。4个灵芝菌株在配方④上子实体干重有所差异,结果显示:GL0003与GL0102在配方④上子实体干重、直径与厚度明显优于GL0057与GL0002,说明菌株GL0003与GL0102比较适合用该培养基栽培。从实验结果可见,GL0003与GL0102在配方④上子实体干重均大于35 g,生物转化率均超过10%。

表1 不同配方菌丝长势比较

备注:小写字母表示5%的显著水平,大写字母表示1%的显著水平；*表示菌丝浓密度较低,**表示菌丝浓密度较高,***表示菌丝浓密度很高;+表示爬壁能力弱,++表示爬壁能力较强,+++表示爬壁能力很强；#表示气生菌丝少,##表示气生菌丝较多,###表示气生菌丝很多。

表2 灵芝微量元素含量测定

图1 不同配方菌丝长势比较Fig.1 Comparison of different formulation

2.3 不同栽培菌种有效成分含量差异

实验结果如图3所示,用甘蔗渣栽培供试的4个灵芝菌株所得子实体总三萜含量较为稳定,都大于10 mg/g,两个市售灵芝子实体的总三萜含量在11～13 mg/g之间,略高于供试的4甘蔗渣栽培的灵芝,不同菌株间总三萜含量存在差异不明显,其中广东椴木灵芝总三萜含量最高,为12.34 mg/g,GL0102最低,含量为10.16 mg/g。甘蔗渣栽培灵芝菌株子实体多糖含量测定结果显示:4个供试菌株子实体多糖含量均高于市售的2个椴木栽培灵芝,4个甘蔗渣栽培灵芝中GL0003子实体多糖含量最低,为34.20 mg/g,但其含量却是广东和安徽灵芝子实体的两倍以上,这可能由于蔗渣栽培灵芝提取液颜色较深,对实验结果产生一定程度的干扰。比较甘蔗渣栽培灵芝与椴木栽培灵芝结果得出:甘蔗渣栽培灵芝子实体总三萜含量稍低于椴木栽培灵芝子实体,但甘蔗渣栽培灵芝子实体多糖含量却是椴木栽培灵芝子实体的两倍以上。另外,由于甘蔗渣栽培灵芝成本低廉,生长周期更短,因此从有效成分角度上看以蔗渣和啤酒糟为主要栽培基质进行灵芝培养可行。

2.4 灵芝微量元素与重金属含量差异分析

几种常见微量元素测定结果如下表2所示,从结果可见,相比其它品种灵芝,利用GL0003栽培的蔗渣灵芝和椴木灵芝富集Mg的能力更强,分别达到1327.5 mg/kg和1246.2 mg/kg;供试的所有样品Ge含量均较低;蔗渣栽培灵芝Se元素含量最高,为0.189 mg/kg;广东椴木灵芝Mn含量显著高于其它组合,达到98.1 mg/kg。

表3 灵芝主要重金属含量测定

图2 不同灵芝栽培农艺性状分析Fig.2 Characters analysis of Ganoderma lucidum cultivation

图3 灵芝子实体有效成分Fig.3 The effective component of Ganoderma lucidum

样品主要重金属元素含量实验结果如表3所示,安徽椴木灵芝和广东椴木灵芝的镉元素含量较高,均超过中国食品安全国家标准[13]规定的小于0.5 mg/kg,其中广东灵芝最高,为0.968 mg/kg;而福建野生灵芝铜和银元素含量显著高于其它组,分别达到60.6 mg/kg和0.961 mg/kg,铜含量超过了国家《药用植物及制剂进出口绿色行业标准》规定的铜含量<20 mg/kg;广东灵芝的铅含量最高,达到1.429 mg/kg,其次为福建椴木栽培灵芝,为1.173 mg/kg,超过国家规定的小于1 mg/kg的范围,这可能是由于覆土栽培过程中土壤铅含量过高引起的,实验结果与唐杰等[15]结论一致;汞含量测定结果显示安徽灵芝最高,为0.139 mg/kg,超过标准规定的小于0.1 mg/kg的范围;砷测定结果中广东市售灵芝最高,为0.374 mg/kg,在标准规定范围内(<1 mg/kg)。纵观所有实验检测指标,相比椴木栽培灵芝,蔗渣灵芝重金属含量相对较低,都在允许范围内,安全性更好。从重金属含量检测分析结果可得利用蔗渣栽培灵芝可行。

3 结论与展望

本研究以4种赤灵芝为出发菌株,筛选出最适灵芝栽培的培养基配方为:甘蔗渣81%,啤酒糟15%,石灰粉3%,糖1%,含水量为65%;在该配方上GL0003,子实体干重38.77 g,生物转化率约为11.7%,子实体直径子实体厚度分别为12.34 cm和19.19 mm,优于高明等[16]筛选出的较优棉花副产物料GMG栽培的灵芝,其单个子实体重量27.82 g,子实体直径9.62 cm厚度0.73 cm;生物转化率高于刘明香等[17]利用茶枝栽培的灵芝。

GL0003菌株多糖含量为34.20 mg/g,总三萜含量为10.87 mg/g。其三萜含量略低于两个市售椴木栽培灵芝,也低于刘明香[17]等用茶枝栽培的子实体(1.25 mg/g),但高于金珊珊等[18]用菌草芒萁与五节芒培养的杂交灵芝子实体;其多糖含量是4个供试菌株中最低的,却优于棉花副产物、菌草和茶枝栽培的子实体,这可能是与甘蔗渣营养组分有关。

灵芝具有较强的富集能力,实验结果显示栽培基质和产区不同其重金属含量存在差异,这与唐波等[19]的报道的结果一致;相比椴木栽培灵芝和野生灵芝,甘蔗渣栽培灵芝重金属含量较低,微量元素Mg、Zn、Se等含量较高,安全性好。

灵芝具有丰富的保健功能,是中国保健食品领域的生力军,但传统以椴木、木屑栽培灵芝不仅成本较高且对环境破坏大,需求更经济、友好的生物资源进行灵芝栽培刻不容缓。甘蔗渣为工业废弃物,甘蔗渣来源广、相对集中、营养丰富,而且属于环境友好型资源,从本实验结果可见利用蔗渣栽培的灵芝其有效成分多糖和三萜的含量也较高,加之利用甘蔗渣栽培灵芝生产成本低、生长周期短,因此利用蔗渣进行灵芝栽培方法可行。目前蔗渣栽培灵芝工艺技术研究还处于起步阶段,蔗渣栽培灵芝有效物质活性及产量的调控技术有待深入研究;随着对蔗渣栽培灵芝生物降解机理和功效的深入研究,菌糠的高值化研究将成为新的研究热点。

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Study ofGanodermalucidumcultivating with bagasses & vinasse and composition analysis

HUANG Qing-hua1,2,3,WANG Qing-fu1,2,3,GAO Yu-feng1,LI Qi-wei1,2,3,LI Jin-rong1,2,3,MENG Fei1,2,3,LIANG Lei1,2,3,*

(1.Guangzhou Sugarcane Industry Research Institute,Guangdong 510316,China; 2.Guangdong Engineering Research&Development Center for Comprehensive Utilization of Plant Fiber,Guangdong 510316,China;3.Guangzhou Key Laboratory for Comprehensive Utilization of Plant Fiber,Guangdong 510316,China)

In this work,the suitable formula for cultivatingGanodermalucidumwas optimized by evaluating the hypha growth rate,climbing ability,density of hypha and aerial hypha biological conversion. The best results were shown for the cultivating with potatoes 200 g,glucose 20 g,agar 20 g,bagasse 20 g,peptone 3 g,KH2PO43 g,MgSO41.5 g,and VB20.1 g per liter. Comparing to the dry weight,thickness and sporophore diameter of four kinds ofGanodermalucidum,GL0003 and GL0102 were proved to be the most suitable species,and their best media components were bagasses 82%,vinasse 15%,lime powder 2%,sugar 15%. The total triterpenoid contents result showed little difference between this two cultivation methods,all of them which grown on bagasse were higher than 10 mg/g;Comparing with basswood groups,the polysaccharide contents of bagasse groups were more than twice. The contents of the main heavy metal elements inGanodermalucidumgrown on bagassewas lower than that on basswood,but its organic magnesium,zinc and selenium content were higher than the basswood group,among them,the content of organic selenium was 0.189 mg/g.

bagasse;vinasse;Ganodermalucidum;heavy mental

2015-01-13

黄清铧(1988-)，女，硕士，研究方向：微生物学、食品发酵，E-mail：kuangwty@163.com。

*通讯作者:梁磊(1980-)，男，博士，高级工程师，研究方向：食品发酵，生物质高值化，E-mail：lianglei214@126.com。

广州市珠江科技新星项目(2014J2200074)；科研院所技术开发研究专项资金(2013EG111222)；转制院所创新能力专项资金(2014EG111227)；广州甘蔗糖业研究所科技基项目(2013-04, B201305)；广东省科技计划项目(2013B0102003)资助；广东省省级科技计划项目(2013B060600001)。

TS255.1

A

1002-0306(2015)21-0143-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.21.021