丁香精油对扩展青霉生长和毒素分泌的影响

罗 曼,姜 辣,陈成花,李 杨,孟祥红

(中国海洋大学食品科学与工程学院,山东青岛 266003)

丁香精油对扩展青霉生长和毒素分泌的影响

罗 曼,姜 辣,陈成花,李 杨,孟祥红*

(中国海洋大学食品科学与工程学院,山东青岛 266003)

为了更全面、合理的评价丁香精油作为防腐保鲜剂对病原菌生长的控制效应及毒素合成间的相关性,以熏蒸的方式,通过离体和活体实验,研究了不同浓度的丁香精油对扩展青霉生长和毒素分泌的影响。结果表明,固体培养中,26.0 μL/L的丁香精油熏蒸对扩展青霉的孢子萌发、菌体生长和毒素分泌均起到明显的抑制作用;虽然在液体培养和活体实验中,相同浓度的丁香精油熏蒸抑制菌体生长同时促进了毒素分泌,但是在这两种实验模式下,当丁香油浓度达到130 μL/L以上时,才达到同时抑制生长和产毒的效果。因此,将丁香精油作为防腐保鲜剂开发时,需同时考虑其对展青霉素分泌的影响,以期达到抑菌效果和食用安全性。

丁香精油,扩展青霉,生长,展青霉素

扩展青霉(Penicilliumexpansum)是引起苹果、梨和桃等大宗水果发生青霉病害的主要病原菌[1],其在生长代谢过程中会分泌一种被称作展青霉素的有毒次级代谢产物。展青霉素具有潜在的细胞和动物毒性,对人和动物存在致畸性、致癌性和免疫毒性[2]。该毒素是一种常见的水果污染物,在苹果、桃、葡萄、梨、樱桃等多种水果及其制品中均有发现[3]。食品中展青霉素的残留问题已引起世界卫生组织的高度关注,许多国家对其最低限量做出了严格规定[4]。

长期以来,安全高效的果实贮藏保鲜技术的研发是农业领域的工作重心之一。目前,使用化学杀菌剂仍是控制果蔬产品采后病害的主要手段,但高剂量化学杀菌剂的使用所造成的环境污染、农药残留和抗药性增加等问题,已引起全社会广泛的关注。因此,寻找安全环保的新型抗菌剂成为国内外抗菌领域的研究热点[5]。丁香精油是从丁香的花蕾、叶子等处提取的芳香精油,属药食同源物品。有研究表明,丁香精油可以抑制柑橘采后主要病原菌指状青霉(Penicilliumdigitatum)、枝孢样枝孢霉(Cladosporiumcladosporioides)的生长[6]。丁香精油对黄曲霉(Aspergillusflavus)、橘青霉(Penicilliumcitrinum)、黑根霉(Rhizopusnigricans)的最小抑菌浓度分别为25、25、50 μL/mL。李鹏霞等[7]发现丁香精油对采后苹果的主要致病菌扩展青霉(Penicilliumexpansum)、灰霉(Botrytiscinerea),炭疽菌(Colletotrichumgloeosporioides)、苹果褐腐病菌(Moniliafructigena)的生长均有较好的抑制作用,并且丁香油处理苹果果实还有利于保持苹果的品质和风味。之前有关丁香精油抑菌作用的研究主要集中在其对菌体生长的抑制作用和对水果品质的影响方面,但丁香精油对扩展青霉的毒素分泌方面的研究鲜有报道。

本文研究了用熏蒸处理的方式,通过离体和活体实验,揭示了丁香精油对扩展青霉生长和展青霉素分泌的影响作用,为丁香精油作为抑菌剂的应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

丁香精油 上海国药集团化学试剂有限公司;乙腈,冰乙酸为色谱纯,其他试剂均为分析纯;展青霉素标准品 美国sigma公司 纯度≥98%;实验用水均为超纯水。扩展青霉(Penicilliumexpansum) 实验室从感染青霉病的苹果果实中分离纯化,回接验证所得,于4 ℃ PDA斜面培养基中暂存;PDA培养基 配方为马铃薯200 g,葡萄糖20 g,琼脂20 g,蒸馏水1 L,自然pH;PDB培养基 配方为马铃薯200 g,葡萄糖20 g,蒸馏水1 L,自然pH。

霉菌培养箱BMJ-250C 上海博讯实业有限公司医疗设备厂;液相色谱仪Agilent-1260 安捷伦科技有限公司;IS-RDS3恒温振荡器 美国精骐有限公司;旋转蒸发仪 上海亚荣生化仪器厂;氮吹仪YGC-12 郑州宝晶电子科技有限公司;光学显微镜BK5000-LEDR 重庆奥特光学仪器有限责任公司;高速分散机T18 basic IKA公司。

1.2 实验方法

1.2.1 菌种的活化和菌悬液的制备 将扩展青霉接种到新鲜PDA斜面上,25 ℃下培养7 d后,加入无菌生理盐水,将菌落表面的孢子刮下,用4层纱布过滤去除菌丝等杂质,用血球计数板在显微镜下观测并将孢子悬浮液浓度调整至106cfu/mL。

1.2.2 孢子萌发实验 本实验均在经UV照射灭菌的无菌操作台内进行。将已灭菌的PDA培养基倒入培养皿中铺成平板,每皿15 mL,均匀涂布50 μL浓度为1×106cfu/mL的扩展青霉的孢子悬浮液,将培养皿倒置,在培养皿盖中央放置一片直径20 mm的已灭菌的圆形滤纸片。用移液枪移取一定体积(0.5、1.0、1.5、2.0 μL)的丁香精油于滤纸片上,使最终浓度分别为6.5、13.0、19.5、26.0 μL/L,以滤纸片上未加丁香精油的平板作为对照。迅速扣好培养皿盖,用封口膜封好培养皿边缘。于25 ℃,相对湿度90%的霉菌培养箱中培养9 h后,在显微镜下观察,测量并计算孢子萌发率。每个处理重复3次,每次重复至少统计200个孢子。

1.2.3 含扩展青霉孢子悬浮液菌饼的制作 取一定体积的孢子悬浮液与45 ℃的PDA培养基混匀,制成含孢子浓度为105cfu/mL的培养基,混匀后倒入90 mm的无菌培养皿中,每皿10 mL,制成厚薄均匀的平板。用无菌打孔器在含菌培养基上切取得到直径9 mm的圆形菌饼。

1.2.4 固体培养实验 将已灭菌的PDA培养基倒入培养皿中铺成平板,每皿15 mL,培养皿内PDA培养基凝固后,取一片9 mm菌饼置于平板中央。将培养皿倒置,在培养皿盖中央放置一片直径20 mm的已灭菌的圆形滤纸片。用移液枪移取一定体积(0.5、1.0、1.5、2.0 μL)的丁香精油于滤纸片上,使最终浓度分别为6.5、13.0、19.5、26.0 μL/L,以滤纸片上未加丁香精油的平板作为对照。迅速扣好培养皿盖,用封口膜封好培养皿边缘。于25 ℃,湿度90%的霉菌培养箱中培养,从培养第5 d开始取样,以后每隔2 d取样。所取样品用十字交叉法测量菌饼直径并计算抑菌率,抑制率(%)=(对照菌落直径-处理菌落直径)/(对照菌落直径-菌饼直径)×100。用无菌水将PDA培养基上的孢子洗去后全部取出,加入15 mL无菌水,用高速分散机打碎均质,提取测量PDA培养基中的展青霉素含量。共统计5个时间点的数据,每组实验设3个平行。

1.2.5 液体培养实验 于无菌250 mL锥形瓶中加入40 mL PDB培养基,接入0.4 mL 1×106cfu/mL的扩展青霉孢子悬浮液,在瓶口内侧固定一片直径20 mm的灭菌滤纸片,用移液枪移取一定体积(1.44、7.22、36.10 μL)的丁香精油于滤纸片上,使最终浓度分别为5.2、26.0、130.0 μL/L,以滤纸片上未加丁香精油的锥形瓶作为对照,用封口膜封住瓶口。将锥形瓶置于25 ℃,相对湿度90%的霉菌培养箱中静置培养。从培养第5 d开始取样,以后每隔2 d取样。所取样品抽滤后,收集菌体,于60 ℃下烘干至恒重,称重。量取5 mL抽滤所得滤液,在滤液中加入15 mL无菌水,混匀,用于提取测量展青霉素含量。共统计5个时间点的数据,每组实验设3个平行。

1.2.6 活体培养实验 挑选成熟期的红富士苹果(MaluspumilaMil),要求外观整齐、大小均匀、无病虫害和机械损伤。用2%的次氯酸钠溶液消毒晾干后,在无菌条件下,用打孔器在苹果的横径上对称地打2个直径4 mm,深4 mm的洞,接入0. 15 mL的1×106cfu/mL的孢子悬浮液。果实晾干后放在330 mm×240 mm×100 mm塑料筐中,用移液枪移取一定体积(178.9、1789.1 μL)的丁香精油于无菌滤纸片上,将该滤纸片迅速放入筐中(勿直接接触苹果),以滤纸片上未加丁香精油的筐作为对照。立即用保鲜膜密封塑料筐,使最终浓度为26.0、260.0 μL/L。置于25 ℃,相对湿度90%的霉菌培养箱中培养。每个处理重复3次,每次10个苹果。从培养第3 d开始取样,以后每隔2 d取样。每次所取样品测量苹果病斑直径,将苹果腐烂病斑部位挖出,加入15 mL无菌水,用高速分散机打碎,用于提取测量展青霉素含量。共统计4个时间点的数据,每组实验设3个平行。

表1 固体培养方式下不同浓度丁香精油对扩展青霉菌丝扩展的抑制率(%)

1.2.7 展青霉素测定方法 将各组取出的待测样品置于锥形瓶中,加入20 mL乙酸乙酯震荡提取1 h,静置分层后,收集上层有机相。重复提取3次,合并3次提取收集的有机相,加入10 mL 1.5%的Na2CO3溶液,震荡1 min,静置分层后,再用10 mL的乙酸乙酯对碳酸钠水层提取一次,合并乙酸乙酯提取液于150 mL梨形蒸发瓶中。于40 ℃水浴上旋转蒸发至1～2 mL,将浓缩液移至离心管中,于40 ℃氮气吹干,以1.0 mL pH4.0的乙酸盐缓冲液溶解残留物,经0.45 μm滤膜过滤后,供高效液相色谱测定。测定条件:色谱柱,Agilent SB-C18柱,250 mm×4.6 mm,粒径5 μm;流动相,乙腈-水(10∶90 v/v);流速,1.0 mL/min;柱温,30 ℃;检测波长,276 nm;进样量,20 μL。

1.3 统计分析

所有数据采用SPSS(SPSS Inc.,Chicago,IL,USA)软件进行统计。实验数据通过ANOVA进行邓肯式多重差异分析。当p<0.05 时,即表示差异显著。

2 结果与分析

2.1 不同浓度的丁香精油对扩展青霉孢子萌发的影响

如图1所示,不同浓度丁香精油对扩展青霉孢子都有抑制效果,抑制作用具有浓度依赖性,高浓度组的抑制效果优于低浓度组。在培养9 h后,对照组(CK)的孢子萌发率已达到93.2%,此时丁香精油浓度最小的6.5 μL/L组的孢子萌发率已低至52.8%,而丁香精油浓度为26.0 μL/L组的孢子萌发率仅为9.9%。

图1 不同浓度丁香精油熏蒸对扩展青霉孢子萌发的影响Fig.1 Effect of clove oil with different concentrations on spore germination of P. expansum

2.2 固体培养方式下丁香精油对扩展青霉生长和产毒的影响

如表1所示,不同浓度丁香精油对扩展青霉孢子都具有一定程度的抑制效果,其抑制作用具有浓度依赖性,抑制作用随着浓度的升高而加强。并且随着培养天数的增加,抑制率不断降低。丁香精油供试浓度最低的6.5 μL/L组抑制效果最差,当培养至11～13 d时,抑制率出现负数,说明此时丁香精油几乎没有抑制效果,甚至表现出对扩展青霉生长的轻微促进作用。丁香精油浓度为26.0 μL/L的处理组抑制效果最佳,从培养第5 d直到第13 d,抑制率始终高于其他组别。

由图2可以看出,随着培养时间的延长,各组的PDA培养基中展青霉素含量均有不同程度的增加。CK、6.5 μL/L、19.5 μL/L这三组的毒素含量随天数变化的趋势相似,均为5～11 d毒素含量增加,培养至第11 d达到峰值,11～13 d毒素含量显著下降。其中,6.5 μL/L组中毒素含量在5～11 d的培养过程中均高于对照组,19.5 μL/L组中毒素含量在5～9 d低于对照组,于第11 d超过对照组。13.0 μL/L组可以看到毒素含量有一个从升高到降低的变化趋势,但具体的变化过程并不明确。仅丁香精油浓度最高的26.0 μL/L组在5～13 d的培养过程中,虽毒素含量随着时间延长逐步升高,但始终低于对照组。

图2 固体培养方式下不同浓度丁香精油熏蒸对展青霉素含量的影响Fig.2 Effect of clove oil with different concentrations on the content of patulin in solid medium

由固体培养实验可以得出,丁香精油浓度为 26.0 μL/L的处理组对扩展青霉菌丝生长和毒素分泌的抑制程度均明显高于其他组别。低于该浓度的丁香精油处理组对扩展青霉的菌丝生长也起到一定的抑制作用,但对展青霉素分泌的抑制作用较差,甚至在培养到一定时间后,促进了毒素分泌。

2.3 液体培养方式下丁香精油对扩展青霉生长和产毒的影响

由图3可以看出,较低浓度(5.2 μL/L)丁香精油熏蒸对扩展青霉菌体生长没有明显作用。而较高浓度的另外两组对扩展青霉菌体生长有明显的抑制作用,且抑制作用随丁香精油浓度升高而增强。浓度最高的130.0 μL/L组菌体生长量极少,并且不随培养时间延长而表现明显差异。

图3 液体培养方式下不同浓度丁香精油熏蒸对扩展青霉菌体生长的影响Fig.3 Effect of clove oil with different concentrations on the mycelial growth of P. expansum in liquid medium

液体培养方式下的展青霉素产量与固体培养方式下有很大区别。其中丁香精油浓度为26.0 μL/L的处理组显著促进了展青霉素的分泌,而另外两个处理组(浓度分别高于和低于26.0 μL/L)均抑制了毒素的分泌。其中,低浓度的5.2 μL/L组对展青霉素的分泌有一定的抑制作用;高浓度的130.0 μL/L组抑制毒素分泌量的效果十分明显(图4)。Garcia等[8]的研究表明,通过强烈抑制菌体生长来阻止菌体分泌次级代谢产物是一种阻止毒素积累的方法。所以本实验中高浓度组可能是因为强烈抑制了菌体生长而导致的产毒量降低。

图4 液体培养方式下不同浓度丁香精油熏蒸对展青霉素含量的影响Fig.4 Effect of clove oil with different concentrations on the content of patulin in liquid medium

2.4 活体培养中丁香精油对扩展青霉生长和产毒的影响

如图5所示,随着培养时间延长,各组苹果的病斑直径逐渐扩大,5 d以内丁香精油处理组对病斑扩展有一定的抑制作用。而7～9 d的培养结果显示,处理组的病斑直径与对照组无显著差异。可能的原因是随着培养时间延长,丁香精油挥发损失,导致筐内丁香精油浓度降低,从而抑菌效果减弱。

图5 不同浓度丁香精油熏蒸对苹果病斑直径的影响Fig.5 Effect of clove oil with different concentrations on lesion diameter of apple注:不同小写字母代表同天不同处理间差异显著(p<0.05)，图6同。

如图6所示,较低浓度的处理组对展青霉素的分泌量没有明显的作用。高浓度组在3～5 d培养过程中可以显著地抑制毒素的分泌,毒素几乎无法检出,5 d后对扩展青霉的抑制作用减弱,毒素含量迅速增多。活体实验中起丁香精油发挥抑菌作用的浓度高于离体实验,可能是由于活体实验中培养环境复杂,干扰因素增多,丁香精油中的主要抑菌成分与苹果中的其他成分相互作用,减弱了抑制产毒的效果。

图6 不同浓度丁香精油熏蒸对苹果上展青霉素分泌量的影响Fig.6 Effect of clove oil with different concentrations on the content of patulin from apple

3 讨论与结论

离体实验结果表明,丁香精油的熏蒸处理对抑制扩展青霉的孢子萌发和菌体生长具有良好的效果,并且随着丁香精油浓度升高而抑制效果增强。之前的研究表明大蒜精油、百里香精油、薰衣草精油也可抑制扩展青霉的孢子萌发[9],这一点上丁香精油的作用效果与其他精油类物质一致。而丁香精油的熏蒸处理对展青霉素的分泌表现出了不同的影响作用。同一丁香精油浓度下,固体培养中扩展青霉的产毒量显著降低,展青霉素的分泌受到强烈抑制;液体培养中,该浓度的丁香精油熏蒸促进了展青霉素的分泌,并随着培养时间的延长毒素产量增多。但当丁香精油浓度提高5倍后,其对展青霉素的分泌也起到了很好的抑制作用。在其他抑菌剂的研究中也存在这种抑菌剂对菌体生长和产毒作用效果不一致的情况。Mossini等[10]研究发现槲皮素可抑制扩展青霉的产毒,但不一致菌体的生长。另有研究表明小豆蔻可减缓黄曲霉的生长但不影响黄曲霉素G1的分泌量[11]。

在活体实验中,丁香精油熏蒸的作用结果与离体培养存在一定差异。在3～5 d的培养过程中,丁香精油对苹果病斑扩展和毒素分泌均有较好的抑制效果,但在培养时间5 d后,效果显著降低。活体实验中抑菌剂效力降低的情况也在抑菌实验中出现。Feng等[12]研究了肉桂精油对樱桃番茄中链格孢病害的抑制作用,在固体培养基中肉桂精油可强烈抑制菌体生长,但在樱桃番茄上用同一浓度的肉桂精油处理时抑制强度有一定程度的降低。Davidson等[13]认为在玉米上有多种因素可影响抑菌剂效力,如脂质可降低起主要抑菌作用的疏水化合物活性,蛋白质可与抑菌剂中某些成分结合。

通过比较菌体生长和毒素分泌这两个测定指标发现,当丁香精油熏蒸抑制菌体生长时,对扩展青霉分泌量的影响是不一样的,根据培养方式和丁香精油浓度的不同,存在促进分泌和抑制分泌两种结果。有研究表明[14],逆境可能促使微生物倾向于合成更多的次级代谢产物。本实验中造成促进毒素分泌结果的可能原因是:特定浓度的丁香精油熏蒸造成了一个逆境环境,从而促使扩展青霉分泌更多的次级代谢产物,即展青霉素。以往的研究中往往只注重丁香精油处理对菌的生长和果实品质的影响,但忽略了对毒素分泌的影响,而扩展青霉在果实中的存在会比腐烂本身对人类造成更为严重的危害。研究结果说明,不仅需要开展抑菌剂对扩展青霉的抑菌效果的评价,还应重视抑菌剂对毒素分泌的影响。目前已有人将丁香精油与大蒜精油、肉桂精油、壳聚糖等配合使用[15-17],并取得了较好的抑菌效果。所以在实际应用中应注意调整丁香精油的添加量,并可以采用与其他物质复配的方法,在抑制扩展青霉菌体生长的同时,有效抑制展青霉素的分泌。

本研究表明,在一定浓度下,丁香精油对扩展青霉的生长和产毒均具有一定的抑制作用,在不同培养方式下,同一浓度丁香精油处理均表现出抑制扩展青霉生长的作用,但对展青霉素分泌量上的影响作用不同,在固体培养中抑制产毒,在液体培养和活体实验中促进产毒。因此,对丁香精油的抑菌性进行评价时,应在考虑其对扩展青霉生长影响的同时,重视其对毒素分泌的影响。该研究可为丁香油作为抑菌剂开发提供重要的理论依据。

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Effect of clove oil on the growth ofPenicilliumexpansumand the production of patulin

LUO Man,JIANG La,CHEN Cheng-hua,LI Yang,MENG Xiang-hong*

(College of Food Science and Engineering,Ocean University of China,Qingdao 266003,China)

In order to evaluate the antibacterial effect of clove oil in a comprehensive and reasonable way,effects of clove oil with different concentrations on the growth ofPenicilliumexpansumand the production of patulin were investigatedinvitroandinvivo. The results showed that 26.0 μL/L clove oil had obvious inhibitory effects on spore germination,the growth ofPenicilliumexpansumand the production of patulin in solid medium. However,treatment of clove oil at the same concentration promoted the production of patulin in liquid medium andinvivounless improving the content of clove oil to 130 μL/L. This study indicated that the effect of clove oil on the production of patulin needed to be considered in order to obtain the antibacterial effect and food safety.

clove oil;Penicilliumexpansum;growth;patulin

2015-01-13

罗曼(1989-)，女，硕士，主要从事天然防腐保鲜剂的研究，E-mail：102384577@qq.com。

*通讯作者:孟祥红(1973-)，男，博士，教授，研究方向：食品生物化学，E-mail：mengxh@ouc.edu.cn。

国家科技计划课题(2012AA101607);国家自然科学基金(31171762)。

TS255.3

A

1002-0306(2015)21-0162-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.21.025