基于宏基因组分析四川泡菜母水作引子的泡菜发酵过程中细菌多样性变化

佟婷婷,田丰伟,王 刚,刘小鸣,张 灏,陈 卫

(江南大学食品学院,江苏无锡 214122)

基于宏基因组分析四川泡菜母水作引子的泡菜发酵过程中细菌多样性变化

佟婷婷,田丰伟,王 刚,刘小鸣,张 灏,陈 卫*

(江南大学食品学院,江苏无锡 214122)

本文旨在研究以泡菜母水作引子的蔬菜发酵过程中细菌多样性变化,并对泡菜质量控制和泡菜中功能性细菌资源开发提供理论支持。采集发酵过程中不同发酵时间的样品,提取基因组,PCR扩增16S rRNA的V3+V4区并进行Illumina高通量测序,通过生物信息学分析比较发酵不同时间细菌多样性。结果表明:以老坛水作引子的发酵过程中发酵启动时魏斯氏菌属可达到74.5%,而之后则在10%左右,取而代之成为优势菌的是乳杆菌属,含量达到80%～85%。说明泡菜发酵中启动菌为魏斯氏菌属,发酵的关键菌为乳杆菌属,同时表明四川泡菜是优良的微生物资源,可用于魏斯氏菌属,乳杆菌属,乳球菌属,片球菌属和明串珠菌属等益生菌的分离和筛选。

宏基因组,泡菜,母水引子,发酵过程,细菌多样性

泡菜是中国的传统发酵蔬菜的代表,其中又以四川泡菜最为著名,是以新鲜蔬菜为原料,添加泡菜盐、水和调味料,利用蔬菜自身附着的微生物或添加乳酸菌发酵剂,自然发酵而成具有独特风味的食品[1]。近年来,四川泡菜作为优秀的菌种资源受到越来越多人的关注,尤其是从中筛选出的优良乳酸菌,具有很多特殊功能,如董玲等从四川泡菜中筛选出了2株产γ-氨基丁酸的短乳杆菌[3],杨婧等则从四川泡菜中获得了一株对细菌和产璞酵母均有良好抑制作用的植物乳杆菌[4],而汪红等从四川泡菜中分离出了一株产酸能力强,生长速度快的乳酸乳球菌[5]。

长期以来,人们主要采取的是传统的菌种筛选方法,随着分子生物学技术的发展,使得从基因角度全面分析环境中的微生物多样性成为可能,而对泡菜中微生物深入的研究有助于更好地利用泡菜资源。田伟[6]等人通过16S rRNA的方法分析了四川泡菜中的细菌多样性,陈功等[7]采用DGGE的方法测定了泡菜中的细菌多样性。宏基因组作为目前分析环境中微生物多样性最有效的方法,在土壤[8]、人类肠道[9]、海水[10]的微生物多样性研究中都有很好的应用,能够对复杂环境中的微生物组成进行有效分析并对不同样品的进化关系探究,而在泡菜中应用极少。本文为了探究四川泡菜发酵过程中细菌的多样性及其变化,特采用宏基因组的方法,以求对四川泡菜发酵过程有更全面的认识,同时为筛选优良菌株提供参考。

表1 16S rRNA V3+V4区基因片段扩增的PCR反应体系

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

泡菜母水 四川省内江市一户农家的老坛(该泡菜采用传统方法泡制且品质符合当地农户对优良泡菜的判定);泡菜盐和花椒等调料 内江菜市场;白萝卜、胡萝卜 无锡雪浪菜市场;DNA提取试剂盒Fast DNA SPIN Kit for soil MP Biomedicals LLC公司;PCR采用TransStart Fastpfu DNA Polymerase TransGen公司;AxyPrep DNA凝胶回收试剂盒 AXYGEN公司;建库试剂盒 TruSeq DNA LT Sample Prep Kit(FC-122001)和上机试剂盒MiSeq Reagent Kit v2,500 Cycles(Catalog # MS-102003) Illumination公司。

Miseq测序仪 Illumina公司;Geldoc 2000凝胶成像系统和PowerPac核酸电泳仪 Bio-Rad公司;PCR仪GeneAmp® 9700型 ABI公司;QuantiFluorTM-ST蓝色荧光定量系统 Promega公司;Nano Drop2000微量分光光度计 Thermo Scientific公司;MS3旋涡混合器 德国IKA公司;Minispin离心机 Eppendorf公司;SCIENTZ-09无菌均质机 宁波新芝生物科技有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 以四川泡菜母水作引子泡菜制备 本实验的泡菜制作模拟传统四川泡菜制作过程,将5 L的泡菜坛用100 ℃水冲洗后,紫外照射下晾干,用泡菜盐和自来水配成浓度为4%的盐水2.5 L,煮沸5 min后冷却至室温入坛,向坛中加入500 mL泡菜母水,50粒花椒和10个鲜辣椒,搅匀;新鲜的白萝卜、胡萝卜去皮,切成2 cm×2 cm×10 cm的蔬菜条,入坛至液面高度距坛口5 cm;盖上盖子,在坛沿加上淡盐水,将泡菜坛置于阴凉处自然发酵。

在第0、1、3、7、16、20 d分别从泡菜坛中取样,共6个样品,分别记作0、1、3、7、16、20 d。样品的处理方式为:将泡制后蔬菜剪碎后与泡菜液一起放入无菌均质袋中,在6档下均质1 min,之后8层无菌纱布过滤取出蔬菜残渣,再将滤液4 ℃,10000 r/min下离心10 min获得菌体,置于-80 ℃冰箱中保存待进一步实验。

1.2.2 泡菜微生物的提取与检测 由于泡菜菌体中会混有蔬菜残渣和调料残渣等,属于复杂的环境体系,故采用QIAGEN粪便基因组提取试剂盒提取样本总DNA,具体操作步骤参照说明书。提取的总DNA经Nanodrop2000微量分光光度计测定纯度,1%琼脂糖凝胶电泳检测[11-12]。

1.2.3 16S rRNA V3+V4区基因片段的扩增及Illumina测序 对于6个样品,由提取的基因组直接扩增V3+V4区基因片段,使用的引物为338F:5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3′和806R:5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′。PCR反应体系见表1。

PCR条件为:95 ℃预变性2 min;95 ℃变性30 s,55 ℃退火30 s,72 ℃延伸45 s,30个循环;72 ℃最终延伸10 min,10 ℃ 保温。每个样品3个重复,将同一样品的PCR产物混合后用2%琼脂糖凝胶电泳检测,使用AxyPrep DNA凝胶回收试剂盒切胶回收PCR产物,Tris_HCl洗脱;2%琼脂糖电泳检测[13-14]。

参照电泳初步定量结果,将PCR产物用QuantiFluorTM-ST蓝色荧光定量系统进行检测定量,之后按照每个样品的测序量要求,进行相应比例的混合。之后用试剂盒TruSeq DNA LT Sample Prep Kit(FC-122001)进行Miseq文库构建:连接“Y”字形接头;使用磁珠筛选去除接头自连片段;利用PCR扩增进行文库模板的富集;氢氧化钠变性,产生单链DNA片段。

针对已构建文库,用试剂盒MiSeq Reagent Kit v2,500 Cycles(Catalog # MS-102003)进行Miseq测序:DNA片段的一段与引物碱基互补,固定在芯片上;另一端随机与附近的另外一个引物互补,也被固定住,形成“桥(bridge)”;PCR扩增,产生DNA簇;DNA扩增子线性化成为单链;加入改造过的DNA聚合酶和带有4种荧光标记的dNTP,每次循环只合成一个碱基;用激光扫描反应板表面,读取每条模板序列第一轮反应所聚合上去的核苷酸种类;将“荧光基团”和“终止基团”化学切割,恢复3′端粘性,继续聚合第二个核苷酸;统计每轮收集到的荧光信号结果,获知模板DNA片段的序列。

1.2.4 生物信息学分析 Miseq测序得到的PE reads首先根据overlap关系进行拼接,同时对序列质量进行质控和过滤,舍弃低质量序列,所得片段大小平均长度为447.31 bp,接近目标片段。区分样品后在97%的相似水平下对OTU(Operational Taxonomic Unit,操作分类单元)进行聚类分析,检测 PCR 扩增中产生的嵌合体序列并从OTU中去除,使用usearch_global方法将优化序列 map比对回OTU代表序列,得到OTU各样品序列丰度统计表[15-16]。

采用RDP classifier贝叶斯算法对97%相似水平的OTU代表序列进行分类学分析,在门和属水平统计每个样品的群落组成。进一步对微生物测序进行深度分析,绘制稀释性曲线(Rarefaction curve)、Shannon-Wiener曲线;对样品的Chao,Ace,Shannon,Simpson指数进行计算,分析细菌群落丰度和多样性;基于细菌群落的组成,在门和属两个分类水平上研究发酵过程中细菌组成和多样性的变化[17]。

2 结果与分析

2.1 样品基因组,OTUs,序列数目分布和测序深度分析

分别对6个样品的总基因组进行提取,并针对16S rRNA V3+V4区基因片段进行PCR扩增,琼脂糖凝胶电泳检测结果见图1。将PCR产物利用高通量Illumina Miseq平台测序,统计得到的序列数目,并在97%的相似水平下进行归类操作得到OTU数,见表2。对测得的序列进行分析,随机对测序所得序列抽样,以抽到的序列数与它们所能代表OTU的数目构建曲线,见图2。当曲线趋于平坦时,说明测序数据量合理,更多的数据量只会产生少量新的OTU;反之则表明继续测序还可能产生较多新的OTU。

图1 6个样品基因组PCR产物电泳检测Fig.1 PCR products of Genom of 6 Samples注:1,2,3,4,5,6分别代表0,1,3,7,16,20 d;DL2000为DNA分子量标准。

由图1可知,6个样品对应的位置都有清晰的条带,证明PCR 产物目的条带大小正确,浓度合适,为后续实验的准确性提供了保障。

表2 6个样品高通量测序数据

由表2可知,6个样品获得的序列数在15400到26100的范围内,在97%的相似水平下对序列进行归类操作,获得的OUT数在14300到25000的范围内。总体上看,除去1 d,发酵后期的序列数和OUT数高于发酵前期。

由图2可知,对于6个样品而言,随着抽取序列数量的增加,它们所代表的OTU数先增加后基本保持不变,即随着测序深度增加,曲线斜率减小,最终趋于平缓,说明测序深度能够较准确地反映泡菜样品的丰富度和多样性。

图2 6个样品稀释曲线Fig.2 Rarefaction Curve of 6 samples

2.2 泡菜发酵过程中不同时间点取样品的细菌多样性分析

针对获得的OTU,利用一系列统计学分析指数可以估计环境群落的物种丰度和多样性,单样品的多样性分析(Alpha 多样性)包括菌群丰度指数chao1和ace,菌群多样性指数simpson和shannon,统计结果见表3。其中,chao1用来估计物种总数,ace可估计群落中OTU数目,simpson和shannon用于估算为生物多样性,simpson越大多样性越低,而shannon越大多样性越高[18]。

表3 菌群多样性指数

由表3可得,simpson越大多样性越低,则多样性由低到高为3,20,1,7,16,0 d;而根据shannon越大多样性越高,则多样性由低到高为3,1,20,7,16,0 d。由此可看出泡菜发酵过程中微生物多样性是变化着的,不是简单的越来越丰富或越来越单一,发酵开始是细菌多样性最高,发酵初期出现细菌多样性下降,到发酵后期又有一定上升。

2.3 泡菜发酵过程中细菌组成在门水平上的变化

为了得到每个OTU对应的物种分类信息,采用RDP classifier贝叶斯算法对97%相似水平的OTU代表序列进行分类学分析,并在门水平(phylum)统计每个样品的群落组成。使用的比对数据库Silva(Release115 http://www.arb-silva.de)。根据各个样品不同门微生物所占比例进行作图,在一个样品中某一门的微生物所占的比例即为其相对丰富度,作图时将相对丰富度低于1%的部分合并为其他在图中显示,结果见图3。

图3 6个样品在门的水平上细菌组成Fig.3 The composition of the samples of bacteria at phylum

由图3中可以看出,在泡菜发酵过程中细菌主要来自厚壁菌门(Firmicutes),蓝藻菌门(Cyanobacteria)和变形菌门(Proteobacteria),其中厚壁菌门所占比例具有绝对优势。由图3分析可知,总体上随着发酵进行,厚壁菌门含量也有升高的趋势,而蓝藻菌门和变形菌门所占比例分别在一定程度上下降。

2.4 泡菜发酵过程中细菌组成在属水平上的变化

为了得到每个OTU对应的物种分类信息,采用RDP classifier贝叶斯算法对 97%相似水平的OTU代表序列进行分类学分析,并在属水平(genus)统计每个样品的群落组成。采用数据库Silva(Release115 http://www.arb-silva.de)进行比对。根据各个样品不同属微生物所占比例进行作图,作图时将相对丰富度低于1%的部分合并为其他在图中显示,结果见图4。

图4 6个样品在属的水平上细菌组成Fig.4 The composition of the samples of bacteria at genus

由图4中可以看出,在属的水平上,泡菜发酵过程中细菌主要属于乳杆菌属(Lactobacillus),魏斯氏菌属(Weissella),乳球菌属(Lactococcus),片球菌属(Pediococcus)和明串珠菌属(Leuconostoc)。通过比较发现,除了1 d中魏斯氏菌属含量最高外,0、3、7、16、20 d中占比最高的均为乳杆菌属。在整个发酵过程中,乳杆菌属整体上的趋势为含量先下降后上升,0 d时为75.6%,1 d时为18.0%,之后的含量在80%～85%之间;魏斯氏菌属0 d几乎没有,1 d时含量达到74.5%,之后保持在10%左右;乳球菌属在0 d时占5.3%,在之后的发酵过程中则几乎没有;片球菌属含量在发酵过程中在1%～7%之间变动,且无明显规律;明串珠菌属在0 d时占4.2%,在之后的发酵过程中几乎没有。由以上规律可推测,泡菜发酵过程中起主导作用的是乳杆菌属;在发酵初期作用显著的是魏斯氏菌属,该菌属在韩国泡菜kimchi中有所报道并且是主要微生物[19];随着发酵进行一些菌属所占的比例从不到6%降到极低,如乳球菌属和明串珠菌属,它们对泡菜的发酵是否起到作用有待进一步探索。魏斯氏菌属在此发酵过程中起到了启动菌的作用,这与一些文献中报道的启动菌是明串珠菌属[20]不符,分析原因可能是此类报道大多参考的是Pederson[21]在1930年时的研究,而魏斯氏菌属与明串珠菌和乳杆菌很相似[22],在1993年时Collins[23]等人根据细菌的16S rRNA将副肠系膜样明串珠菌属(Leuconostoc paramesenteroides)和相关菌重新分类,形成了魏斯氏菌属(Weissella),因此在这之前的研究可能鉴于当时分类水平的限制并没有进行正确的鉴定;同时也有可能是研究对象和条件不同造成差异,如Eom等人的研究选用明串珠菌作为韩国泡菜kimchi的启动菌[24-25]。魏斯氏菌属作为启动菌还有待进一步研究。

3 结论

本研究利用Illumina高通量测序获得16S rRNA的V3+V4可变区序列,基于该分子标志鉴定泡菜的细菌种类,说明V3+V4序列在泡菜细菌的分类中解析度良好。通过测序及生物信息学分析,可得出如下结论:在泡菜发酵过程中,微生物多样性是变化着的,而不是简单的越来越丰富或越来越单一。在门的水平上看,泡菜发酵过程中细菌主要来自厚壁菌门,蓝藻菌门和变形菌门,其中厚壁菌门所占比例具有绝对优势。在属的水平上,泡菜发酵过程中细菌主要属于乳杆菌属,魏斯氏菌属,乳球菌属,片球菌属和明串珠菌属。除了1 d中魏斯氏菌属含量最高外,0、3、7、16、20 d中占比最高的均为乳杆菌属。因此欲从发酵蔬菜中分离得魏斯氏菌属,则可对发酵初期的发酵液进行微生物分离筛选,同时可推测魏斯氏菌属是在蔬菜发酵的启动中起重要作用。发酵后期的发酵液则是乳杆菌属微生物的优良来源。随着发酵进行含量降到极低的乳球菌属和明串珠菌属可能因为不适合发酵后期的环境而受到抑制。本文仅分析了发酵过程中不同阶段的细菌多样性组成,而不同菌属具体如何作用需要代谢组学进一步探索。

[1]李淑华,蒲彪,陈封政. 泡菜的功能及防腐研究进展[J].中国酿造.2005(4):6-8.

[2]陈功,夏有书,张其圣,等.从中国泡菜看四川泡菜及泡菜坛[J].中国酿造.2010(8):5-8.

[3]董玲,朱宇,姚英政,等.四川泡菜中产γ-氨基丁酸微生物的分离及鉴定[J].食品与发酵科技,2013,49(4):77-80.

[4]杨婧,尹礼国,马伟玲,等.四川泡菜中乳酸菌的抗菌性研究[J]. 中国调味品,2014,39(7):4.

[5]汪红,曹瑜,罗时宇,等.四川泡菜乳酸菌的分离鉴定及其特性研究[J]. 四川大学学报：自然科学版,2008,45(6):1509-1512.

[6]田伟,张琦,邓珍珍,等.利用16SrRNA分析传统四川发酵泡菜中的细菌多样性[J].食品科学,2013,34(17):215-218.

[7]陈功,余文华,张其圣,等.四川泡菜与乳酸菌的研究[J]. 中国酿造,2012,31(9):15153.

[8]Renata CS,Mariangela H.,Mauricio EC,et al. Metagenomic analysis reveals microbial functional redundancies and specificities in a soil under different tillage and crop-management regimes[J]. Applied Soil Ecology,2015,86(0):106-112.

[9]Eamonn PC,Roy DS,Julian RM,et al. Functional metagenomics reveals novel salt tolerance loci from the human gut microbiome[J]. The ISME Journal,2012,6(10):1916-1925.

[10]Francesco S,Enzo M,Violetta L,et al. Metagenomic analysis of hadopelagic microbial assemblages thriving at the deepest part of Mediterranean Sea,Matapan-Vavilov Deep[J]. Environmental Microbiology,2013,15(1):167-182.

[11]Huber JA,Mark Welch DB,Morrison HG,et al. Microbial population structures in the deep marine biosphere[J].Science,2007,318(5847):97-100.

[12]Cole JR,Wang Q,Cardenas E,et al. The Ribosomal Database Project:improved alignments and new tools for rRNA analysis. Nucleic Acids,2009,Res. 37(Database issue):D14145;doi:10.1093/nar/gkn879][PMID:19004872].

[13]Edgar RC. UPARSE:highly accurate OTU sequences from microbial amplicon reads[J]. Nature Methods,2013,10(10):996-998.

[14]Oberauner L,Zachow C,Lackner S,et al. The ignored diversity:complex bacterial communities in intensive care units revealed by 16S pyrosequencing[J]. Sci. Rep.,2013,3:1413.

[15]Maughan H,Wang PW,Diaz Caballero J,et al. Analysis of the Cystic Fibrosis Lung Microbiota via Serial Illumina Sequencing of Bacterial 16S rRNA Hypervariable Regions. PLoS ONE,2012,7(10):e45791. doi:10.1371/journal.pone.0045791.

[16]Schloss PD,Gevers D,Westcott SL. Reducing the Effects of PCR Amplification and Sequencing Artifacts on 16S rRNA-Based Studies. PLoS ONE,2011,6(12):e27310. doi:10.1371/journal.pone.0027310.

[17]Huson DH,Mitra S,Weber N,et al. Integrative analysis of environmental sequences using MEGAN4[J]. Genome Research,2011,21:1551560.

[18]Kemp PF,Aller JY. Bacterial diversity in aquatic and other environment:what 16S rDNA libraries can tell us[J]. FEMS Microbiology Ecology. 2004,47(2):16177.

[19]Lee J-S,Heo G-Y,Lee J W,et al. Analysis of kimchi microflora using denaturing gradient gel electrophoresis[J]. International Journal of Food Microbiology,2005,102(2):143-150.

[20]刘甜甜,谭兴和. 蔬菜发酵的微生物及其对产品风味的影响[J]. 农产品加工,2012,(05):73-76.

[21]CS Pederson. Floral changes in the fermentation of Sauerkraut[R]. Geneva,New York:New York State. State Tech Bulletin.1930.

[22]王海娟,戴雨珂,潘渠. 魏斯氏菌的研究现状[J]. 成都医学院学报,2014,(06):747-750.

[23]Collins M D,Samelis J,Metaxopoulos J,et al. Taxonomic studies on some leuconostoc-like organisms from fermented sausages:description of a new genus Weissella for the Leuconostoc paramesenteroides group of species[J]. Journal of Applied Bacteriology,1993,75(6):595-603.

[24]Eom H-J,Seo D M,Han N S. Selection of psychrotrophic Leuconostoc spp. producing highly active dextransucrase from lactate fermented vegetables[J]. International Journal of Food Microbiology,2007,117(1):667.

[25]Eom H-J,Park J,Seo M,et al. Monitoring of Leuconostoc mesenteroides DRC starter in fermented vegetable by random integration of chloramphenicol acetyltransferase gene[J]. Journal of Industrial Microbiology & Biotechnology,2008,35(9):953-959.

Metagenomic analysis of bacterial diversity changes during vegetables fermentation using Sichuan pickle water as starter

TONG Ting-ting,TIAN Feng-wei,WANG Gang,LIU Xiao-ming,ZHANG Hao,CHEN Wei*

(School of Food Science and Technology,Jiangnan University,Wuxi 214122,China)

The purpose of the present study was to investigate the bacterial diversity in Sichuan pickles during the fermentation started by mother water starter,in order to provide support for the quality control and functional bacterial screening in pickles. Samples during the fermentation were collected for genome extraction,and the V3+V4 parts of 16S rRNA of each sample’s genome were amplified by PCR. The samples were then sequenced by Illumina miseqsequencing system. Bioinformatics was finally analyzed to compare bacterial deversity of the samples. The results showed that,the abundance of Weissella was 74.5% at the beginning of the fermentation but then decreased and remained stable at about 10%. After the start of the fermentation,the Lactobacillus strains took place to be the dominationated bacteria,with a content of 80%～85%. These results indicated that during the fermentation,Weissella was the starter culture and Lactobacilli dominated the fermentation process afterwards. It can be concluded that Sichuan pickles were proved to be excellent microbial resources for the collection of probiotics including Weissella,Lactobacillus,Lactococcus,Pediococcus and Leuconostoc strains.

Metagenome;pickled vegetables;mother water starter;fermentation process;bacterial diversity

2015-01-23

佟婷婷(1990-)，女，硕士研究生，研究方向：食品生物技术,E-mail:tongtt2015@163.com。

*通讯作者:陈卫(1966-)，男，博士，教授，研究方向：食品生物技术,E-mail:chenwei66@jiangnan.edu.cn。

国家科技支撑计划(2013BAD18B01)；国家自然科学基金(31371721)。

TS201.3

A

1002-0306(2015)21-0173-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.21.027